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脓毒症是急危重症医学领域的重大难题，其中免疫细胞凋亡是脓毒症免疫功能障碍的重要原因。而在机体免疫系统中，树突细胞(dendritic cell，DC)作为人体最重要的抗原提呈细胞，是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁，其功能变化在脓毒症发生发展过程中的作用不可替代，DC凋亡在脓毒症免疫功能障碍发病机制中具有重要意义，与脓毒症预后密切相关。高迁移率族蛋白B1(high mobilitygroup box-1 protein，HMGB1)是脓毒症重要的晚期炎症介质，我们早期研究发现HMGB1体外刺激对DC免疫功能状态具有双向调节作用，但HMGB1介导DC凋亡效应及相关分子机制尚未明确。内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是真核细胞重要内源性保护机制，在一定程度上通过未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)对理化因素、病原体、细胞因子等刺激应激下细胞发挥保护作用，帮助细胞恢复正常功能。而ERS持续存在或过强则启动相关凋亡信号通路的活化诱导细胞凋亡的发生。我们前期研究结果表明，HMGB1作为炎症介质，体外刺激可诱导DC发生明显ERS，可能是HMGB1调控DC免疫功能的重要机制。ERS是否参与HMGB1介导DC凋亡效应尚不明确。内质网与线粒体功能结构上紧密相依，在细胞的生命活动中发挥重要作用。研究表明，定位于线粒体-内质网结构偶联(mitochondria-endoplasmic reticulum physicalcoupling,or mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane(MAM))的多种分子通过影响内质网-线粒体之间的交互作用调节细胞功能。线粒体融合蛋白2(Mitofusin2，Mfn2)是目前定位在MAM上相关蛋白的研究热点，与细胞的活化、凋亡等生理病理变化等存在重要联系。更有研究报道Mfn2可与ERS三条关键信号通路的启动子之一PERK形成直接物理连接，对PERK-eIF2α通路的激活起着重要调控作用。本文采用分离培养的原代小鼠脾脏DC和小鼠DC细胞系(DC2.4)来探讨Mfn2-PERK在HMGB1介导DC凋亡效应及相关机制中的作用及意义。 研究目的和方法: 1.分离培养正常BALB/c雄性小鼠脾脏DC，用不同浓度HMGB1(1，10，100ng/mL)刺激后培养24小时(h)，应用流式细胞术检测DC凋亡，Western blotting检测DC中ERS标志分子GRP78表达水平、PERK表达活化水平及ERS介导细胞凋亡的关键分子CHOP表达水平。 2.进一步应用PERK抑制剂GSK2656157和Salubrinal(eIF-2α去磷酸化酶抑制剂)调控ERS相关通路关键分子的活性，探究其对HMGB1介导DC凋亡效应的影响。 3.稳定培养可传代的DC2.4细胞系，验证HMGB1刺激的凋亡诱导效果及ERS反应情况;应用共聚焦显微镜检测Mfn2在内质网上的定位。 4.应用Mfn2过表达慢病毒载体转染DC2.4，稳定表达后再给予HMGB1刺激(10ng/mL,24h)，观察细胞凋亡情况，应用流式细胞术检测DC凋亡，Westernblotting法检测培养细胞ERS相关因子GRP78、p-PERK/PERK和CHOP，以及Mfn2表达水平，探讨Mfn2对PERK信号通路活化的调节作用以及对DC凋亡的影响。 结果: 1.HMGB1刺激后小鼠脾脏DC凋亡增加，HMGB1刺激48h后在不同剂量组小鼠脾脏DC凋亡率较24h时间点有所增加(P＜0.05)，其中以HMGB1(10ng/ml)刺激组细胞凋亡率最高(P＜0.01)，但24h和48h差异并不明显。应用HMGB1刺激后ERS相关蛋白GRP78、PERK、p-PERK和CHOP表达上调，其中GRP78表达随剂量的增加而增加(P＜0.05)，而PERK、p-PERK和CHOP表达在10ng/ml刺激组最强(P＜0.01)。 2.Salubrinal干预可抑制HMGB1诱导的小鼠脾脏DC凋亡(P＜0.05)，下调GRP78、PERK、p-PERK和CHOP表达水平;而应用PERK抑制剂GSK2656157干预可导致HMGB1作用下DC凋亡水平明显增加(P＜0.01)。 3.HMGB1刺激DC2.4细胞株凋亡增加，与HMGB1介导DC凋亡效应相当，在10 ng/ml刺激24h作用明显。同时伴随PERK蛋白表达上调、活性增加(P＜0.05)，CHOP表达升高(P＜0.05)。 4.HMGB1刺激导致小鼠脾脏DC内Mfn2表达降低，且随刺激剂量的增加而减少(P＜0.05)，HMGB1刺激下DC2.4细胞株的Mfn2蛋白表达亦明显降低(P＜0.05)。 5.LV-Mfn2-GFP慢病毒转染DC2.4细胞株可提高Mfn2表达水平，而细胞内PERK表达及活化水平均有所降低(P＜0.05)。同时HMGB1(10ng/ml)刺激下DC2.4细胞凋亡率明显下降(P＜0.05); CHOP表达水平亦降低(P＜0.05)。 结论: 一定浓度的HMGB1刺激可诱导DC凋亡的发生，其机制与ERS相关细胞凋亡通路的激活相关;HMGB1刺激DC可导致Mfn2表达降低，而Mfn2过表达则可通过抑制PERK的活化，降低HMGB介导的DC凋亡。M如2-PERK相互作用在对抑制HMGB1刺激DC诱导过度ERS的发生、降低DC凋亡具有重要意义。