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马铃薯是世界上重要的粮菜兼用型作物,马铃薯生长需要大量水分且对盐敏感,本研究目的是将条斑紫菜6-磷酸海藻糖合成酶基因(PyTPS)导入马铃薯后获得转基因植株,为筛选出耐盐、抗旱的转基因品系奠定基础。主要研究结果如下:
1、建立了以微型薯切片和茎段为外植体直接形成不定芽的再生途径
选用微型薯切片、试管苗茎段为外植体材料,建立了直接形成不定芽途径的再生途径。鲁引一号、夏波蒂、克新18、大西洋、费乌瑞它5个品种微型薯切片不定芽直接诱导优化培养基为:2MS+2mg/LIAA+1mg/L6-BA+4mg/LZT+6mg/LKT,分化率分别为95.0%、97.5%、87.5%、97.5%、82.5%;Desiree品种茎段不定芽直接诱导培养基为:2MS+1mg/LAA+1mg/L6-BA+2mg/LZT+3mg/LKT,分化率为90.1%。
2、建立了以微型薯切片和茎段为外植体愈伤形成与分化途径
5个品种微型薯切片愈伤诱导的培养基为2MS+4mg/L6-BA+0.5mg/LNAA,鲁引一号、夏波蒂、克新18、大西洋、费乌瑞它愈伤诱导率分别为92.5%、97.5%、82.5%、95.0%、77.5%,5个品种分化培养基为2MS+5mg/L6-BA+1mg/LZT,分化率分别为87.5%、95.0%、77.5%、95.0%、77.5%;Desiree品种茎段愈伤诱导的培养基2MS+2mg/L6-BA+0.5mg/LNAA,愈伤诱导率为90.1%,分化培养基为2MS+5mg/L6-BA+2mg/LZT,分化率为91.4%。不定芽在MS基本培养基上可顺利生根,形成完整的植株。
3、进行了试管苗耐盐性初步研究
将NaCl添加到MS基本培养基中进行盐胁迫实验。设置0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%NaCl浓度对马铃薯试管苗进行胁迫处理,结果表明,0.2%NaCl是植株普遍可以耐受的盐浓度。NaCl浓度增大到0.6%、0.8%、1.0%时,试管苗停止生长,均不能生根。
4、建立了农杆菌介导的转化体系,获得了转基因植株
建立和优化了转化体系:最终确定预培养时间为3天,Km的浓度为50mg/L,Carb浓度为500mg/L,农杆菌浓度为OD值为0.5,侵染时间为5分钟,共培养时间为2天。用农杆菌EHA105(pCAMBIA2300-PyTPS)侵染鲁引一号马铃薯的微型薯切片外植体,经卡那霉素抗性筛选获得了抗性不定芽,卡那霉素抗性植株经PCR检测扩增出了500bp的特异性片段,即获得了鲁引一号品种的转基因植株。
5、对转基因植株的耐盐性进行了鉴定
通过0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%浓度的NaCl胁迫处理对转基因植株进行耐盐性实验,结果表明,NaCl达到0.4%和0.6%时,未转基因植株生长缓慢,不能生根,植株生长受到抑制,而转基因植株在NaCl浓度达0.8%仍能正常生根,生长速度也比未转基因植株快。结果表明转基因植物的耐盐性有一定的提高。