两性霉素B(Amphotericin B,Am B)是临床上重要的多烯大环内酯类抗生素,具有广谱抗真菌活性,被广泛应用于治疗全身性真菌感染。两性霉素B生物合成过程中代谢调控机制较为复杂,现代基因工程及代谢工程技术已被广泛应用于提升菌种的生产性能以满足两性霉素B市场需求的增长,但针对发酵方面的研究较少。为进一步提高两性霉素B的发酵水平并降低生产成本,新型发酵调控策略的开发显得极为重要。本论文针对实验室前期筛选出的一株两性霉素B高产结节链霉菌,在已有代谢组分析的基础上,研究关键前体和差异代谢物作为添加物对两性霉素B生物合成的影响,结合分阶段调控策略以及补料方式的发酵工艺优化,以达到提高两性霉素B产量和降低副产物两性霉素A含量的目的。根据摇瓶发酵过程中显著代谢差异分析筛选关键前体和差异代谢物,提出理性设计的单因素优化及正交联合添加策略,发现在发酵24 h时,同时加入4 mg/L异丙醇,89 mg/L丙氨酸,1 g/L丙酮酸和25 mg/L烟酰胺是最优添加物补加策略,最终摇瓶水平的Am B产量为6.47 g/L,提高了25.4%,表明不同添加物可通过影响重要中间代谢过程,从而显著影响Am B的生物合成过程。为进一步促进Am B的生物合成,对5 L发酵罐中最适初始葡萄糖浓度及搅拌转速等培养条件进行优化,确定最适初糖浓度及转速分别为70 g/L和500 rpm。鉴于两性霉素B发酵属于部分生长偶联型,提出分阶段调控策略,研究了分阶段p H、温度及溶氧控制策略对发酵产Am B的影响,发现分阶段p H 7.0,温度30℃/26℃和DO 20%控制策略为最优调控策略,在这三种策略下,Am B产量最终由分批发酵时的9.89 g/L分别提升到12.66 g/L,11.79 g/L和11.28 g/L,并通过胞外有机酸分析阐明在合成Am B时,不同调控策略对菌体代谢过程的影响,进一步说明结合代谢控制的发酵调控策略对两性霉素B生物合成的整个过程起决定性作用。基于摇瓶添加物研究,在5 L发酵罐进行添加物补加放大实验,证明了在5 L发酵罐中同时添加上述四种化合物的有效性,Am B产量为12.56 g/L,可提高27.0%左右,副产物Am A含量为2.3%,下降24.8%,推测原因可能是Amph C PKS模块5中的烯酰还原酶结构域催化活性降低导致Am A合成受到抑制;对5 L发酵罐补料调控方式进行优化,包括脉冲补料、p H-Stat及DO-Stat补料、恒速补料、变速补料及恒定残余葡萄糖浓度补料等6种补料方式,最终确定1.5 g/(L·h)流速下的恒速补料是最优补料策略,此时最高Am B产量达到15.79 g/L,较分批发酵提高59.7%,但副产物Am A含量从3.1%增加到7.1%;考虑到补料培养基成分较单一,对补料培养基进行优化,确定最优补料培养基为200 g/L葡萄糖,5 g/L蛋白胨和0.3 g/L硫酸铵。基于前期实验研究,为最有效提高Am B产量并降低副产物Am A含量,进行最佳联合调控策略下的分批补料发酵,即同时采用分阶段p H、温度及DO控制策略,并在发酵24 h时补加4 mg/L异丙醇、89 mg/L丙氨酸,1 g/L丙酮酸和25 mg/L烟酰胺四种添加物,以1.5 g/(L·h)的流速进行恒速补料,Am B产量最终达到18.39 g/L,较分批发酵提高85.9%,最大菌体量(PMV)达到45.0%,副产物Am A含量为2.1%,较分批发酵显著降低32.8%;通过胞外有机酸的检测,α-酮戊二酸,丙酮酸和柠檬酸浓度的变化被确定为最关键的代谢物节点,从而进一步阐明了该发酵调控策略下可能的代谢机制:其本质是在发酵过程特性分析下以α-酮戊二酸等物质代谢流为控制要点,调节菌体的生长和代谢,使物质代谢最大程度地向有利于产物合成的代谢途径进行,使Am B效价增加。最后在50 L发酵罐上进行工艺放大研究,上述不同的发酵调控策略为Am B的工业化生产提供了新的指导。