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在植物生长发育和响应逆境胁迫的过程中，组蛋白修饰是重要的表观遗传调控方式。其中组蛋白乙酰化修饰(Kac)是目前研究最为广泛的修饰之一，由组蛋白乙酰转移酶和去乙酰化酶共同调控。最新研究表明，巴豆酰化修饰(Kcr)和丁酰化修饰(Kbu)作为两种新型的组蛋白酰化修饰，同样被组蛋白乙酰化修饰酶调控。在植物中，组蛋白修饰调控基因表达和响应逆境胁迫的表观机制还有待进一步研究。本研究主要对水稻中Kcr和Kbu修饰进行了全基因组分布特征解析;解析水稻组蛋白H3K14ac/cr修饰在低温胁迫下的变化特征和调控作用;同时通过CRISPR/Cas9技术构建水稻组蛋白去乙酰化酶家族RPD3/HDA1相关基因遗传材料，并对该家族基因功能进行分析。本研究主要工作包括:
1.水稻全蛋白组赖氨酸巴豆酰化(Kcr)修饰定性分析
本研究首先通过IF与WB分析发现水稻中广泛存在巴豆酰化修饰。进一步利用LC-MS/MS技术首次在水稻叶片中定性出1265个Kcr修饰位点，涉及690个蛋白:在Kcr修饰的多肽中鉴定出6个明显的保守基序，分别是Kcr*V、Kcr*I、Kcr*L、KcrD、DKcr、和EKcr;GO分析表明Kcr修饰的蛋白主要参与了蛋白质合成、光合作用以及糖酵解等多种代谢途径;亚细胞定位显示51％的Kcr修饰蛋白位于叶绿体上;蛋白网络互作分析表明Kcr修饰蛋白主要与核糖体、光合作用以及糖酵解有关;并且组培白化苗的Kcr修饰水平显著低于组培绿苗。这些结果表明Kcr在植物光合作用中具有重要的调控作用。
2.水稻组蛋白Kcr修饰的全基因组分布特征解析
在定性分析中，我们发现了7个组蛋白Kcr修饰位点。通过ChIP-seq分析表明水稻中组蛋白Kcr主要富集在基因上(86.7％)尤其是外显子区域，并且富集的丰度与基因的表达量成正比。进一步通过与H3K9ac，H4K12ac，H3K4me2，H3K36me3和H3K27me3的ChIP-seq数据进行比较，我们发现组蛋白Kcr的peak区与促进基因表达的活性修饰(H3K9ac，H4K12ac，H3K4me2和H3K36me3)高度重叠，同时存在时可提高活性基因的表达。13.3％的组蛋白Kcr修饰主要富集在基因间区，可能与调控序列相关。本研究的Kcr与DNase I超敏位点(DHSs)在基因间区有77％的重叠，水稻中的理想株形转录因子IPA1与DHSs有88％的重叠，而与组蛋白Kcr在启动子与基因间区都只有6％的重叠，表明Kcr可能修饰着除了IPA1以外的其他顺式作用元件。
3.水稻组蛋白赖氨酸丁酰化(Kbu)修饰的全基因组分布特征解析
组蛋白赖氨酸丁酰化修饰是近期在水稻中发现的一种四碳链的新型酰化修饰。ChIP-seq的结果显示水稻中组蛋白Kbu修饰主要富集在基因上，尤其是外显子区域。并且其富集水平与基因的表达量成正比。进一步通过与超敏感位点(DHSs)和其它已公布的组蛋白修饰的ChIP-seq数据进行比较分析，发现基因间区上Kbu的富集区域有60.06％与DHSs重叠;同时与转录活性修饰H3K4ac，H3K9ac和H3K23ac分布特征相似，并且当基因上同时出现Kbu和Kac修饰时，该基因的表达量比只有Kac修饰时显著增高。结果表明组蛋白Kbu是一个转录活性修饰并且可以和其它活性修饰一起促进基因更高表达。GO富集分析表明在不同的水稻品种中，Kbu修饰的基因调控转录、结合和应激反应等多种代谢途径。
4.水稻组蛋白Kcr与Kbu共定位分析
通过以上分析表明，组蛋白Kcr与Kbu是水稻中存在的两种新型酰化修饰，并且都可促进基因表达。因此进一步对这两种修饰进行共定位分析。研究表明，Kcr与Kbu共同修饰的基因数为8，913个，GO功能注释分析显示这些基因主要与生物大分子合成以及代谢进程相关;在细胞组分中，与生物大分子合成代谢的场所有关，如核仁、核糖体、高尔基体等。暗示着这两个新酰化修饰可能共同参与了生物大分子的合成与代谢途径。Kcr与Kbu共同富集的peaks数为9，574个。通过生物信息学分析这些peaks共得到265个特异motifs，并且这些motifs与992个转录因子的结合位点相关。这些结果表明，两种新型酰化修饰都在植物的生长发育中具有重要作用。
5.低温逆境下水稻组蛋白酰化修饰特征解析
组蛋白修饰是植物响应逆境胁迫的重要表观调控方式。通过Western Blot分析，我们发现水稻幼苗在低温4℃处理10h后，组蛋白H3K14ac、H3K36ac以及H3K14cr的修饰水平都明显上调，而Kbu在H3和H4上都明显下调。我们选择位于同一位点上的H3K14ac和H3K14cr修饰进一步研究其与胁迫响应基因的调控关系。通过RNA-seq分析发现差异表达基因的GO注释分析主要富集在应激反应、代谢过程以及光合作用中。ChIP-seq分析表明，低温胁迫下乙酰化修饰水平发生变化的基因数要多于巴豆酰化修饰;其中低温逆境响应基因DREB1A表达量显著提高，并且其启动子与基因上H3K14ac/cr的修饰水平明显上升。通过相关性分析发现，水稻在低温胁迫下基因表达水平与H3K14ac修饰水平的变化呈正相关，而与H3K14cr的相关性较低。对差异修饰的基因进行GO分析，结果显示H3K14ac/cr修饰水平上调且差异表达上调的基因都富集在胁迫响应进程上。这暗示着H3K14ac与H3K14cr都参与了低温胁迫响应，且H3K14ac占主导作用。
6.水稻组蛋白去乙酰化酶OsHDA701、OsHDA702和OsHDA706基因功能研究
在酵母中，RPD3和HDA1家族具有明显的去乙酰化酶活性，与之同源的RPD3/HDA1家族是植物中最大的一类HDACs亚家族。通过同源序列比对和系统进化树分析发现，水稻RPD3/HDA1家族主要包括14个蛋白，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了以中花11为受体材料的OsHDA701纯合突变体株系，和以日本晴为受体材料的OsHDA702和OsHDA706纯合突变体株系。
其中OsHDA701主要在穗和根中表达，敲除突变体在扬州正季株高显著矮于野生型;而在海南南繁期间，株高极显著高于野生型。不同环境条件下，突变体的粒长变长、粒厚变薄，但籽粒的千粒重与粒宽没有明显变化。WB分析结果显示，突变体中组蛋白H3K36ac、H3K27ac，H3K14ac和H4K8ac修饰水平明显上升，尤其是H3K14ac;而H3K18ac和H4K5ac则没有明显变化。但是，H3K14cr修饰水平显著降低，H3K18cr没有显著变化。表明OsHDA701具有去乙酰化酶的活性，同时OsHDA701敲除后会影响巴豆酰化修饰的富集。在250C/200C条件下，OsHDA70/突变体生育期比野生型延迟，突变体中抽穗期相关基因RFT1的表达量上调，而Hd1、Ghd2、Ghd7、Hd18、Ehd1、OsSET34等表达量下调;在35℃/28℃条件下，生育期比野生型提前，突变体中抽穗期相关基因Ghd2、Hd3a、Hd18、Ghd7等表达量上调，RFT1、Ehd1表达量下调。同时不同生长条件下，H3K18ac/cr修饰水平变化完全相反。这些结果表明OsHDA701可能参与了不同温度条件下水稻生育期相关基因的表达调控。
以日本晴为背景的OsHDA702纯合突变体株系无法进入生殖生长，最终致死。表明OsHDA702是植物由营养生长向生殖生长过渡的关键基因。对OsHDA702突变体进行WB分析，发现只有H3K14cr修饰水平相比子野生型升高，而部分乙酰化修饰水平降低了，尤其是H3K14ac。这表明OsHDA702是水稻生殖生长阶段的关键基因，且具有去巴豆酰化酶的功能，同时OsHDA702敲除后会影响乙酰化修饰的富集。
以日本晴为背景的OsHDA706纯合突变体株系株高明显变矮，穗长变短，分蘖数显著降低，结实率极差，植株出现早衰的现象。对OsHDA706突变体进行WB分析，H3K36ac、H3K27ac和H4K8ac修饰水平降低。表明是OsHDA706对水稻生长发育至关重要，OsHDA702敲除后会影响乙酰化修饰的富集，而不影响巴豆酰化修饰。
以上研究初步表明，组蛋白去乙酰化酶家族RPD3/HDA1家族基因对水稻的生长发育有重要影响，但可能不完全具有去除组蛋白乙酰化或巴豆酰化的功能。相关研究结果为进一步解析相关基因在水稻中的生物学功能奠定重要基础。
1.水稻全蛋白组赖氨酸巴豆酰化(Kcr)修饰定性分析
本研究首先通过IF与WB分析发现水稻中广泛存在巴豆酰化修饰。进一步利用LC-MS/MS技术首次在水稻叶片中定性出1265个Kcr修饰位点，涉及690个蛋白:在Kcr修饰的多肽中鉴定出6个明显的保守基序，分别是Kcr*V、Kcr*I、Kcr*L、KcrD、DKcr、和EKcr;GO分析表明Kcr修饰的蛋白主要参与了蛋白质合成、光合作用以及糖酵解等多种代谢途径;亚细胞定位显示51％的Kcr修饰蛋白位于叶绿体上;蛋白网络互作分析表明Kcr修饰蛋白主要与核糖体、光合作用以及糖酵解有关;并且组培白化苗的Kcr修饰水平显著低于组培绿苗。这些结果表明Kcr在植物光合作用中具有重要的调控作用。
2.水稻组蛋白Kcr修饰的全基因组分布特征解析
在定性分析中，我们发现了7个组蛋白Kcr修饰位点。通过ChIP-seq分析表明水稻中组蛋白Kcr主要富集在基因上(86.7％)尤其是外显子区域，并且富集的丰度与基因的表达量成正比。进一步通过与H3K9ac，H4K12ac，H3K4me2，H3K36me3和H3K27me3的ChIP-seq数据进行比较，我们发现组蛋白Kcr的peak区与促进基因表达的活性修饰(H3K9ac，H4K12ac，H3K4me2和H3K36me3)高度重叠，同时存在时可提高活性基因的表达。13.3％的组蛋白Kcr修饰主要富集在基因间区，可能与调控序列相关。本研究的Kcr与DNase I超敏位点(DHSs)在基因间区有77％的重叠，水稻中的理想株形转录因子IPA1与DHSs有88％的重叠，而与组蛋白Kcr在启动子与基因间区都只有6％的重叠，表明Kcr可能修饰着除了IPA1以外的其他顺式作用元件。
3.水稻组蛋白赖氨酸丁酰化(Kbu)修饰的全基因组分布特征解析
组蛋白赖氨酸丁酰化修饰是近期在水稻中发现的一种四碳链的新型酰化修饰。ChIP-seq的结果显示水稻中组蛋白Kbu修饰主要富集在基因上，尤其是外显子区域。并且其富集水平与基因的表达量成正比。进一步通过与超敏感位点(DHSs)和其它已公布的组蛋白修饰的ChIP-seq数据进行比较分析，发现基因间区上Kbu的富集区域有60.06％与DHSs重叠;同时与转录活性修饰H3K4ac，H3K9ac和H3K23ac分布特征相似，并且当基因上同时出现Kbu和Kac修饰时，该基因的表达量比只有Kac修饰时显著增高。结果表明组蛋白Kbu是一个转录活性修饰并且可以和其它活性修饰一起促进基因更高表达。GO富集分析表明在不同的水稻品种中，Kbu修饰的基因调控转录、结合和应激反应等多种代谢途径。
4.水稻组蛋白Kcr与Kbu共定位分析
通过以上分析表明，组蛋白Kcr与Kbu是水稻中存在的两种新型酰化修饰，并且都可促进基因表达。因此进一步对这两种修饰进行共定位分析。研究表明，Kcr与Kbu共同修饰的基因数为8，913个，GO功能注释分析显示这些基因主要与生物大分子合成以及代谢进程相关;在细胞组分中，与生物大分子合成代谢的场所有关，如核仁、核糖体、高尔基体等。暗示着这两个新酰化修饰可能共同参与了生物大分子的合成与代谢途径。Kcr与Kbu共同富集的peaks数为9，574个。通过生物信息学分析这些peaks共得到265个特异motifs，并且这些motifs与992个转录因子的结合位点相关。这些结果表明，两种新型酰化修饰都在植物的生长发育中具有重要作用。
5.低温逆境下水稻组蛋白酰化修饰特征解析
组蛋白修饰是植物响应逆境胁迫的重要表观调控方式。通过Western Blot分析，我们发现水稻幼苗在低温4℃处理10h后，组蛋白H3K14ac、H3K36ac以及H3K14cr的修饰水平都明显上调，而Kbu在H3和H4上都明显下调。我们选择位于同一位点上的H3K14ac和H3K14cr修饰进一步研究其与胁迫响应基因的调控关系。通过RNA-seq分析发现差异表达基因的GO注释分析主要富集在应激反应、代谢过程以及光合作用中。ChIP-seq分析表明，低温胁迫下乙酰化修饰水平发生变化的基因数要多于巴豆酰化修饰;其中低温逆境响应基因DREB1A表达量显著提高，并且其启动子与基因上H3K14ac/cr的修饰水平明显上升。通过相关性分析发现，水稻在低温胁迫下基因表达水平与H3K14ac修饰水平的变化呈正相关，而与H3K14cr的相关性较低。对差异修饰的基因进行GO分析，结果显示H3K14ac/cr修饰水平上调且差异表达上调的基因都富集在胁迫响应进程上。这暗示着H3K14ac与H3K14cr都参与了低温胁迫响应，且H3K14ac占主导作用。
6.水稻组蛋白去乙酰化酶OsHDA701、OsHDA702和OsHDA706基因功能研究
在酵母中，RPD3和HDA1家族具有明显的去乙酰化酶活性，与之同源的RPD3/HDA1家族是植物中最大的一类HDACs亚家族。通过同源序列比对和系统进化树分析发现，水稻RPD3/HDA1家族主要包括14个蛋白，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了以中花11为受体材料的OsHDA701纯合突变体株系，和以日本晴为受体材料的OsHDA702和OsHDA706纯合突变体株系。
其中OsHDA701主要在穗和根中表达，敲除突变体在扬州正季株高显著矮于野生型;而在海南南繁期间，株高极显著高于野生型。不同环境条件下，突变体的粒长变长、粒厚变薄，但籽粒的千粒重与粒宽没有明显变化。WB分析结果显示，突变体中组蛋白H3K36ac、H3K27ac，H3K14ac和H4K8ac修饰水平明显上升，尤其是H3K14ac;而H3K18ac和H4K5ac则没有明显变化。但是，H3K14cr修饰水平显著降低，H3K18cr没有显著变化。表明OsHDA701具有去乙酰化酶的活性，同时OsHDA701敲除后会影响巴豆酰化修饰的富集。在250C/200C条件下，OsHDA70/突变体生育期比野生型延迟，突变体中抽穗期相关基因RFT1的表达量上调，而Hd1、Ghd2、Ghd7、Hd18、Ehd1、OsSET34等表达量下调;在35℃/28℃条件下，生育期比野生型提前，突变体中抽穗期相关基因Ghd2、Hd3a、Hd18、Ghd7等表达量上调，RFT1、Ehd1表达量下调。同时不同生长条件下，H3K18ac/cr修饰水平变化完全相反。这些结果表明OsHDA701可能参与了不同温度条件下水稻生育期相关基因的表达调控。
以日本晴为背景的OsHDA702纯合突变体株系无法进入生殖生长，最终致死。表明OsHDA702是植物由营养生长向生殖生长过渡的关键基因。对OsHDA702突变体进行WB分析，发现只有H3K14cr修饰水平相比子野生型升高，而部分乙酰化修饰水平降低了，尤其是H3K14ac。这表明OsHDA702是水稻生殖生长阶段的关键基因，且具有去巴豆酰化酶的功能，同时OsHDA702敲除后会影响乙酰化修饰的富集。
以日本晴为背景的OsHDA706纯合突变体株系株高明显变矮，穗长变短，分蘖数显著降低，结实率极差，植株出现早衰的现象。对OsHDA706突变体进行WB分析，H3K36ac、H3K27ac和H4K8ac修饰水平降低。表明是OsHDA706对水稻生长发育至关重要，OsHDA702敲除后会影响乙酰化修饰的富集，而不影响巴豆酰化修饰。
以上研究初步表明，组蛋白去乙酰化酶家族RPD3/HDA1家族基因对水稻的生长发育有重要影响，但可能不完全具有去除组蛋白乙酰化或巴豆酰化的功能。相关研究结果为进一步解析相关基因在水稻中的生物学功能奠定重要基础。