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阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)是一种重要的食源性条件致病菌,可以引起新生儿严重的脑膜炎,坏死性小肠结肠炎和菌血症等疾病,在新生儿中有较高的致死率。该菌已从多种食品和环境样品中检出。建立快速、特异、灵敏的阪崎肠杆菌检测方法对于食品安全监控具有重要意义。以PCR技术为基础的检测方法,因其灵敏度高、特异性强、检测速度快等优势,在食源性致病菌的快速检测中具有广阔的应用前景。本研究建立了食品中阪崎肠杆菌新的PCR检测体系,研究内容主要包括以下几个方面：1.阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)常规双重PCR检测方法的建立针对阪崎肠杆菌遗传的多样性、分类的复杂性,以及单重PCR检测方法易于产生假阳性的问题。本试验以阪崎肠杆菌基因组16S rRNA基因以及局部大分子合成(macromolecular synthesis, MMS)操纵子的特异序列为靶序列,设计两对引物,经反应体系和条件优化,建立了常规双重PCR检测方法,并对检测方法进行了评价。特异性检测结果显示,阪崎肠杆菌菌株PCR扩增均可见2条特异性条带,而其他菌株PCR扩增均为阴性。纯菌检测双重PCR的灵敏度为6.3×103CFU/mL,而相对应16S rRNA和MMS操纵子序列单重PCR的灵敏度分别为6.3×101CFU/mL和6.3×103CFU/mL.人工污染的食品样品(奶粉、牛奶、鸡肉)在经过24h增菌后,检测限均可达100CFU/mL(或CFU/g).在鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)存在的条件下,双重PCR检测方法的检测限没有受到影响。本试验建立的常规双重PCI检测方法具有很好的特异性和灵敏度,能克服食品样品基质及杂菌的干扰,可应用于食品中阪崎肠杆菌的检测。2.含有扩增内标的阪崎肠杆菌Taqman荧光定量PCR检测方法的建立在pTG-19载体上选取一段与靶序列同源性较低的序列,采用复合引物法构建竞争性扩增内标,并设计相应探针。以大分子合成(MMS)操纵子序列为靶序列,优化并建立了含有扩增内标的阪崎肠杆菌real-time PCR检测方法。对67株菌株(4株阪崎肠杆菌)进行了检测,结果所有阪崎肠杆菌检测都为阳性,其他菌株都为阴性,且扩增内标都可见扩增信号。纯培养物和奶粉中该检测方法的检测限均为1.2×103CFU/mL (1.2×101CFU/反应),人工污染的食品样品在经过24h增菌后可以检测低至100CFU/mL (g)的阪崎肠杆菌。在108CFU/mL鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)存在的情况下real-time PCR检测方法的检测限并没有受到影响。因此本研究中具有高特异性和灵敏性的real-time PCR检测方法可用于食品中阪崎肠杆菌的快速检测,并且扩增内标的加入可有效降低假阴性结果出现的可能。3.快速检测方法在食品检测中的应用为了评价快速检测方法的准确度,并了解阪崎肠杆菌在食品中的分布情况,本研究对6种(92份)食品样品进行了阪崎肠杆菌检测。分别使用传统生化培养鉴定方法和本研究建立的快速检测方法(常规双重PCR方法和real-time PCR方法)对食品样品进行阪崎肠杆菌检测。结果3种检测方法都从一份猪肉样品中检出了阪崎肠杆菌,与传统检测方法对比,本研究建立快速检测方法一致性均为98.9%(91/92),并且未出现漏检现象。