研究目的:乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个重大的公共卫生问题。慢性乙型肝炎病毒(CHB)感染是肝损伤和炎症的主要诱因,如未及时得到有效治疗,大约25%的CHB患者可以发展为纤维化、肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌(HCC)。CHB患者难以治愈的主要是,在CHB患者肝脏中形成的免疫抑制的微环境中,调节性T细胞(Tregs)和髓系来源抑制性细胞(MDSCs)的比例升高,干扰并抑制T细胞介导的抗HBV功能,最终导致体内抗原特异性的CD8+T细胞处于无能的状态。目前临床治疗CHB的药物有核苷(酸)类似物(Nucleotide/Nucleoside analogues,NAs)和干扰素α两大类,但两类药物对于治疗CHB都具有一定的局限性,不能实现长期的病毒学控制。为了克服目前临床CHB治疗的局限性,目前国内外科研工作者们正研发新的治疗药物以实现乙肝治疗终极目标,而HBV治疗性疫苗是本世纪CHB治疗研究领域研究的热点。治疗性乙肝疫苗是针对CHB患者或HBV携带者,通过不同途径呈递乙肝抗原,旨在打破机体的免疫耐受,提高机体特异性CD4+T细胞、CD8+T细胞和体液免疫应答,最终达到清除乙肝病毒的目的。免疫佐剂是能够增强机体对抗原(Ag)特异性免疫应答的物质。但是到目前为止,美国食品药品监督管理局批准上市的佐剂只有铝佐剂,MF-59、AS03以及AS04等几种,限制了治疗性乙肝疫苗的研究。因此,需要寻找新的治疗性乙肝疫苗佐剂,以用于临床CHB的治疗。宿主细胞表面或细胞质中表达的模式识别受体(PRR),如Toll样受体(TLR)、RIG-I样受体、NOD样受体等,可以识别微生物中的病原体相关分子模式(PAMP)。已有文献报道,PAMP作为疫苗的免疫佐剂可以促进抗原呈递细胞(APC)的活化。作为一种合成的dsRNA(TLR3配体),聚肌苷-聚胞苷酸钠盐(poly I:C)可以激活TRIF依赖的信号通路,诱导I型干扰素的表达和抗HBV免疫反应。而且,由于TLR3分子在具有交叉呈递功能的树突状细胞(DC)上高度表达,poly I:C的刺激可以增强DC对外源性抗原的交叉递呈,从而诱导机体产生抗原特异性的CD8+T细胞应答。这些发现提示,poly I:C可以作为一种潜在的疫苗佐剂用于抗病毒,尤其是慢性HBV的治疗。尽管已有文献报道,polyI:C可以诱导机体产生抗HBV的免疫应答,但是HBV特异性CD8+T细胞的特性以及CD8+T细胞不同亚群的作用仍不清楚。此外,目前还没有关于polyI:C是否可以诱导免疫记忆或实现长期病毒学控制的报道。在本研究中,我们基于慢性HBV感染诱导机体免疫耐受的特点,利用TLR3激动剂polyI:C作为HBV治疗性疫苗的佐剂(简称“pHBV疫苗”),通过“初免-加强”(prime-boost)的免疫策略皮下接种,证明pHBV疫苗在抗HBV中的潜在应用价值,并阐述了短寿命效应细胞(SLECs)在慢性HBV治疗过程中发挥的关键作用和相应的机制,为临床治疗慢性HBV提供了新的理论和实验依据思路。研究方法:1.通过尾静脉高压注射pAAV/HBV 1.2至C57 BL/6J小鼠或者CD11c-DTR小鼠体内,建立HBV-carrier小鼠模型或者HBV-carrier-CD 11 c-DTR小鼠模型。2.通过“初免-加强”的免疫策略,以一周为时间间隔,皮下接种3次。3.通过CLIA、ELISA分别检测小鼠血清中HBsAg、、anti-HBs的水平。通过荧光定量PCR检测血清中HBV DNA copies的含量。通过荧光定量PCR检测肝组织中HBV cccDNA、HBV DNA、HBV total RNA、HBV-3.5kb-RNA的含量。4.通过Southern blot检测肝组织中HBV cccDNA的水平。5.通过ELISA检测小鼠血清中IL-12的水平。6.通过赖氏微板法检测小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)的水平。7.通过免疫组化检测肝组织原位HBcAg的表达;通过HE染色检测肝组织损伤。8.利用IL-4和GM-CSF体外诱导骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)。9.利用白喉毒素清除HBV-carrier-CD11c-DTR小鼠体内的DCs。10.通过肝脏原位灌流分离小鼠原代肝实质细胞,并通过免疫荧光和流式细胞术检测EGFP的表达。11.通过流式细胞术分离小鼠的淋巴细胞并过继转输至受体鼠体内。12.通过流式细胞术检测小鼠来源的单个核细胞膜分子、胞内分子及核转录因子的表达水平。13.通过MTT法和CFSE法检测脾淋巴细胞的增殖能力。14.通过尾静脉高压注射pAAV/HBV 1.2至免疫后的C57 BL/6J小鼠体内,观察其对再次感染HBV的抵抗能力。研究结果:一、HBV 慢性感染小鼠模型中存在多种HBV DNA中间体1.高压注射后质粒进入肝脏并持续表达通过尾静脉高压注射的pAAV/HBV 1.2质粒可以进入肝脏并能长期持续存在。2.HBV 慢性感染小鼠模型中存在多种HBV DNA中间体尾静脉高压注射pAAV/HBV 1.2质粒的方式所建立的HBV慢性感染小鼠模型中有多种HBV DNA中间体的存在,包括HBV cccDNA、HBV rcDNA、ss HBV DNA、dsl AAV-HBV中间体。二、poly I:C作为佐剂与rHBV疫苗联合使用能够安全有效的清除HBV1.单独使用 poly I:C或者rHBV疫苗不能清除HBV与Untr组相比,单独使用poly I:C或者rHBV疫苗治疗后不能有效的降低HBV-carrier小鼠中的HBV cccDNA、HBsAg、HBV DNA、HBV total RNA、HBV-3.5 kb-RNA的水平,也不能诱导机体产生保护性的anti-HBs。同时,经poly I:C或者rHBV疫苗单独治疗的小鼠也不能保护机体防止HBV的再次感染。2.pHBV 疫苗能够有效的清除HBV与Untr组相比,pHBV疫苗治疗组小鼠外周血血清中HBsAg的水平有明显的下降,并且治疗效果可以维持至少4周的时间。同时,血清HBV DNA和肝内HBV DNA、HBV RNA,尤其是HBV cccDNA,在pHBV疫苗治疗后的小鼠中几乎检测不到。免疫组化染色显示,HBcAg+的肝细胞在pHBV疫苗治疗后几乎消失。此外,pHBV疫苗组anti-HBs水平在治疗后的第5周检测到有明显的上调趋势。3.pHBV 疫苗治疗不引起小鼠肝脏炎症损伤与Untr组相比,虽然在pHBV疫苗治疗后肝脏中有单核细胞的浸润,但是肝脏HE切片染色和血清学ALT的水平检测显示,在治疗周期中小鼠的肝脏并无明显肝细胞损伤。三、pHBV疫苗增强机体DC的成熟和抗原递呈功能1.pHBV疫苗增强体内DC的成熟和分化与Untr组相比,单独使用poly I:C和pHBV疫苗治疗均可增加小鼠外周血和引流淋巴结中DC的比例以及DC表面分子MHC-Ⅱ、CD86和CD80的表达,而rHBV疫苗单独免疫组对CD11c+DC无明显的影响。与未加poly I:C处理组相比,当用不同浓度的poly I:C体外刺激BMDC时,能明显增加DC对FITC标记的OVA抗原(FITC-OVA)的吞噬作用,同时,DC表面MHC-Ⅱ以及共刺激分子CD80、CD86的百分比以及MFI的水平在poly I:C刺激后均有明显上调,且呈浓度依赖性的增加。2.pHBV疫苗诱导产生的抗HBV作用依赖于DC的功能HBV-carrier-CD11c-DTR小鼠腹腔注射白喉毒素后外周血中CD11c+ DC的比例以及DC上MHC-Ⅱ的表达明显降低,经疫苗治疗后,清除HBV的能力显著降低。四、pHBV疫苗能改善机体的免疫抑制环境与Untr组相比,pHBV疫苗治疗能明显降低小鼠肝细胞上免疫抑制分子PD-L1的表达。同时,治疗后小鼠肝脏以及脾脏中Tregs、MDSCs的比例也有一定程度的降低。五、pHBV疫苗诱导机体产生的抗原特异性CD11ahi CD8α1o细胞介导机体对病毒的清除1.CD11ahi CD8a1o细胞为抗HBV特异性的CD8+T细胞pHBV疫苗治疗后的小鼠肝脏、脾脏中总的CD3+T细胞以及CD4++T细胞、CD8+T细胞的比例以及CD8+T细胞的绝对数均增加,并且我们检测了治疗后更长时间(3周)时脾脏中T细胞亚群的变化,得到了一致的现象。治疗后小鼠肝脏部位的CD8+T细胞活化分子CD69的表达以及分泌抗病毒细胞因子IFN-γ、TNF-α的能力增加。CFSE标记的全脾细胞、CD8α+T细胞、CD11ahi CD88αlo T细胞转输至新的HBV-carrier小鼠体内后表现出显著的抗原特异性增殖,而CD11alo CD8αhi T细胞没有明显的增殖,并且全脾细胞和CD8α+T细胞中增殖的细胞为CD11ahi CD8αlo表型。分离不同治疗组小鼠的全脾细胞,用HBsAg体外刺激72 h,也证明增殖的细胞为CD11ahi CD8αlo表型。2.pHBV疫苗诱导机体产生抗原特异性CD11ahi CD8αlo细胞抗原特异性的CD11ahi CD8αlo细胞的比例在pHBV治疗后小鼠的脾脏、肝脏以及外周血有明显的增加。与Untr组相比,pHBV疫苗治疗后1周以及3周的小鼠脾淋巴细胞在体外经过HBsAg刺激时均发生明显的抗原特异性的增殖。抗原特异性的CDllahi CD8αlo细胞高表达增殖核抗原Ki-67。rHBVvac或poly I:C单独处理组小鼠CD11ahi CD8αlo细胞的比例没有明显的变化。单独转输CD11alo CD8ααhi细胞不能清除HBV,而转输全脾细胞、CD8+T细胞和CDl1ahi CD8αlo细胞组均能显著降低HBV-carrier小鼠模型中HBsAg的水平,而且单独转输CD11ahi CD8aαlo与CD8+T细胞就能达到与转输全脾细胞相近的治疗效果。与转输CD11alo CD8αhi细胞组相比,转输CD11ahi CD8αlo细胞组能够降低血清中HBV DNA的水平,而且肝脏免疫组化染色显示HBcAg+的肝细胞几乎消失。3.pHBV疫苗诱导机体产生抗原特异性CD11ahi CD49dhi CD4+T细胞辅助CD8+T细胞应答pHBV疫苗接种后,小鼠脾脏部位的CD4+T细胞分泌抗病毒细胞因子IFN-γ、TNF-α的能力增加,且HBV特异性CD11ahi CD49dhi CD4+T细胞比例明显升高。六、pHBV疫苗逆转了HBV特异性CD8+T细胞的耗竭状态并诱导产生KLRG1+CD8+T细胞1.pHBV疫苗逆转了HBV特异性CD8+T细胞的耗竭pHBV疫苗治疗可以明显地降低肝脏和脾脏组织中抗原特异性的CD11ahi CD8αloT细胞上LAG-3、CTLA-4、TIGIT、PD-1、Tim-3和Eomes 的表达水平;表达两种细胞因子(IFN-γ+ IL-2+、IFN-γ+ TNF-α+以及IL-2+ TNF-α+)的多功能CD8+T细胞增加,表达一种细胞毒性相关分子(CD107a+、granzym B+、perforin+)的CD8+T细胞的比例在pHBV疫苗治疗也显著增加。2.pHBV疫苗诱导KLRG1+ CD8+T细胞的产生与Untr组相比,pHBV疫苗治疗组小鼠外周血KLRG1+ CD8+T细胞百分比以及KLRG1的MFI值在治疗周期中有明显的上调,且维持在较高的水平。与Untr组相比,治疗后小鼠的肝脏、脾脏中KLRG1+CD8+T细胞的比例也具有明显的提高。更为有意义的是,我们发现KLRG1只表达在HBV特异性的CD11ahi CD8αlo细胞上,而在非特异性的CD11alo CD8αhi细胞上几乎没有表达。七、pHBV疫苗促进CD8+ T细胞的终末分化1.pHBV疫苗促进了SLECs的形成pHBV疫苗治疗可以促进CD8+ T细胞的终末分化,肝脏、脾脏和外周血中SLECs的比例和绝对数明显增加。SLECs 比MPECs表达更高的增殖核抗原Ki-67分子,而rHBV疫苗或poly I:C单独治疗并不能促进SLECs的形成。2.SLECs在清除HBV过程中占有主导地位与MPECs相比,SLECs高表达IFN-γ、CD107a、granzymB 和perforin,低表达免疫抑制分子Tim-3。供者来源的CD11ahi CD8αlo细胞发挥清除HBV作用的同时,其SLECs的比例在血液、脾脏和肝脏中明显增加,而供者来源的CD11a1o CD8αhi细胞没有检测到SLECs 比例的明显变化。3.pHBV疫苗通过降低MPEC上Eomes表达而促进CD8+T细胞的终末分化在慢性HBV-carrier小鼠模型中,与MPECs相比,肝脏、脾脏的SLECs低表达Eomes,且pHBV疫苗治疗可以降低肝脏、脾脏的MPECs上Eomes的表达。八、pHBV疫苗诱导产生的HBV特异性SLECs能保护机体防止HBV的再次感染1.pHBV疫苗免疫能保护机体防止HBV的再次感染在再次进行HBV的感染后,与Untr小鼠相比,经pHBV疫苗免疫的小鼠几乎检测不到血清HBsAg,而且有50%以上的小鼠体内产生了高水平的保护性anti-HBs。pHBV疫苗免疫的小鼠几乎检测不到肝内的HBV cccDNA、HBV DNA、HBV RNA、HBcAg+肝细胞以及血清中的HBV DNA。CXCR5+PD-1+滤泡辅助性T细胞的比例随着HBV再次感染而增加。2.SLECs在HBV免疫记忆中起关键作用在再次进行HBV的感染后,与Untr小鼠相比,经pHBV疫苗免疫的小鼠的肝脏和脾脏中SLECs的比例和绝对数显著增加,而MPECs没有显示任何显著变化;肝脏中SLECs的比例与HBV再次感染后第5天血清HBsAg的水平呈明显的负相关关系(p<0.01)。同时,CD8+T细胞上KLRG1的表达也与血清HBsAg水平呈负相关(p<0.05)。与Untr小鼠相比,用pHBV疫苗免疫的小鼠中MPECs表达高水平的CD62L,同时血清中IL-12水平增加。结论及意义:1.本研究证明,利用TLR3激动剂poly I:C作为HBV治疗性疫苗的佐剂制备pHBV疫苗能安全有效地清除HBV。2.发现pHBV疫苗能够打破慢性HBV感染诱导的免疫耐受状态,诱导DC的成熟与活化,恢复耗竭的HBV特异性CD11ahi CD8αlo T细胞亚群的功能。3.发现pHBV疫苗治疗可以诱导长期免疫记忆,保护机体防止HBV的再感染,其中pHBV疫苗诱导的短寿命效应细胞(SLECs)可能在预防HBV再感染中发挥重要作用。4.研究提示,pHBV疫苗可能是临床治疗慢性乙型肝炎的潜在候选疫苗,在临床治疗后可较好地预防HBV感染的复发。