胞嘧啶核苷,也称为胞苷,是核苷类保健食品与药物重要的原料,市场需求量很大。胞苷主要通过微生物发酵方法获得,但现有菌株的胞苷发酵水平不高,受到多种因素影响。优化菌株细胞内胞苷的合成代谢方式及提高胞苷分泌效率是提高发酵单位的主要途径。胞苷可能是通过多种转运方式进行跨膜转运的,尿嘧啶通透酶(pyrP,EC3.1.3.104,由pyrP基因编码,分子量48KDa)和核苷转运蛋白(NupC,EC2.3.1.256,由NupC基因编码,分子量43 KDa)可能与胞苷分泌过程有关。本研究通过构建尿嘧啶通透酶和核苷转运蛋白NupC过表达体系,分析这两个基因的过表达对菌体细胞生长与胞苷发酵的影响,研究尿嘧啶通透酶和核苷转运蛋白在胞苷分泌过程的作用,从而不断提高菌体发酵胞苷的产率。具体研究内容如下:1、异源pyP基因过表达载体构建及其对胞苷发酵的影响。从解淀粉芽孢杆菌BG-09基因组DNA上PCR扩增pyrP基因,并与pSTV28载体进行连接构建质粒载体pSTV28-pyrP。采用化学转化法将其转入Escherichia coliBG-08中,得到重组菌E.coliBG-08P。使用0.5 mmol/L IPTG诱导6h后,离心、收集菌体细胞,超声破碎取上清液,通过SDS-PAGE电泳分析,结果发现在48 kDa处蛋白条带较对照组明显增强。重组菌E.coli BG-08P在36℃、180 rpm发酵40 h,分析菌体浓度、葡萄糖消耗速率、pH以及胞苷产量。结果发现,重组菌与对照组比较生长情况无明显差别,过表达异源pyrP基因对菌株生长无影响,葡萄糖消耗速率的变化趋势与对照菌株一致,发酵液中的胞苷浓度为0.91±0.03 g/L,是对照菌株的1.30倍,表明过表达pyrP基因对胞苷的分泌有积极促进作用。2、异源NupC基因过表达载体构建及其对胞苷发酵的影响。从解淀粉芽孢杆菌BG-09基因组DNA上PCR扩增NupC基因,连接到pSTV28载体上,构建质粒载体pSTV28-NupC。采用化学转化法将其转入E.coliBG-08中,得到重组菌E.coliBG-08C。使用0.5 mmol/L IPTG诱导6 h后,收集菌体细胞,超声破碎取上清液,通过SDS-PAGE电泳分析,结果发现在43 kDa处蛋白条带较对照组明显增强。将重组菌E.coli BG-08C在36℃、180 rpm发酵40 h,分析发酵过程中菌体浓度、葡萄糖消耗速率、pH以及胞苷产量。结果发现,重组菌与对照组比较生长情况无明显差别,过表达异源NupC基因未对菌株的生长造成影响,葡萄糖消耗速率的趋势与对照菌株一致,发酵液中的胞苷浓度为1.26±0.05g/L,是对照组的1.80倍,表明过表达NupC基因对胞苷发酵单位的提高有积极促进作用。3、异源pyrP和NupC基因串联过表达载体构建及其对胞苷发酵的影响。将pyrP和NupC基因串联拼接到pSTV28载体上,构建质粒载体pSTV28-pyrP-NupC,转化到E.coli BG-08中,获得重组菌E.coliBG-08PC。使用0.5mmol/LIPTG诱导6h后,离心、收集菌体细胞,超声破碎取上清液,通过SDS-PAGE电泳分析,在43 kDa和48 kDa处出现两条明显蛋白条带。重组菌E.cooiBG-08PC在36℃、180 rpm发酵40 h,对发酵过程中的菌体浓度、葡萄糖消耗速率、pH以及胞苷产量分析可知,重组菌与对照组比较生长情况无明显差别,表明过表达异源串联基因不会对菌株的生长造成影响,葡萄糖消耗速率的趋势与对照菌株一致,发酵液中的胞苷浓度为1.59±0.05g/L,是对照组的2.27倍。说明这两个基因的串联表达对胞苷浓度的提高有协同促进作用。4、pyrP和NupC基因在发酵中对胞苷分泌的促进作用。通过对构建的重组菌株E.coli BG-08P、E.coli BG-08C、E.coliBG-08PC和对照菌株比较分析。结果发现,发酵过程中的菌体浓度、葡萄糖消耗速率、pH与对照菌株差异不大,发酵液中胞苷浓度均有不同程度的提高,说明单独过表达pyr基因,增加了细胞中尿嘧啶通透酶的生成,增强了嘧啶的转运,促进了胞苷的分泌;单独过表达NupC基因,增加核苷转运蛋白的合成剂量,触发了细胞膜两侧胞苷结合位点的交替开放,增强了胞苷的转运作用;串联表达pyP和NupC基因,与对照菌株相比胞苷产量有了大幅度提高,表明这两个基因在胞苷分泌过程中发挥着协同促进的作用。