论文部分内容阅读
小鼠作为重要的模式动物之一，其全基因组序列信息已由小鼠基因组计划(mouse genomes project，MGP)解析，99%的基因与人的基因同源。小鼠的生理结构及代谢过程与人类相似，是研究人类复杂性状最理想的模型。小鼠遗传学中，数量性状基因座位(quantitative trait loci，QTL)定位的策略主要分为连锁分析和关联分析。但是，传统近交系小鼠亚种来源单一、遗传多样性匮乏等特点，很难快速定位克隆复杂性状相关的功能基因。因此，亟需开发新的小鼠资源满足我们的科研需求。染色体替换小鼠基因组的特点为只携带了一条供体小鼠的染色体以及受体小鼠除此染色体以外的遗传背景，研究集中在基因组背景均一且已知的一条染色体上，QTL定位效果更为稳定且容易被检测到。多年来，我们课题组采集了全国25个不同地区的野生小鼠，以野生小鼠为供体并以C57BL/6J(B6)小鼠品系为受体，通过连续6-8代不断地回交以及3-5代兄妹自交的方式，成功构建野生小鼠1号染色体替换系群体(chromosome 1 substitution lines， C1SLs)。该群体除了1号染色体来源于野生小鼠外，其余染色体均被B6小鼠所替代。通过血液生化分析，我们发现不同地区来源的C1SLs血脂和血糖水平拥有显著性差异，并且在广西大新地区来源的品系中出现不同程度后肢发育缺陷的小鼠。为了鉴定C1SLs群体中血脂血糖调控基因及肢体发育缺陷相关基因，本论文主要开展了以下两个部分的研究。
第一部分：利用肝脏表达谱筛选C1SLs中血脂异常的候选基因。小鼠1号染色体上含有大量与血脂代谢相关的QTL，但是许多血脂代谢基因仍未被定位克隆。我们构建的野生小鼠来源1号染色体替换系群体(C1SLs)，除了1号染色体不同外，其他染色体均与B6小鼠相同。因此，C1SLs和B6之间的表型差异都可以推断源于1号染色体的差异。我们检测了13个C1SLs小鼠(1号染色体分别来自于上海嘉定、浙江杭州、上海崇明、山东临沂、云南昆明、山东枣庄1、山东枣庄2、河南三门峡、浙江八里店、上海松江、江苏天王、广西大新和上海杨浦)及B6小鼠中的血脂和血糖水平，发现C1SLs小鼠和B6小鼠的总胆固醇(total cholesterol，CHOL)、甘油三酯(triglyceride， TG )、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol ， HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol， LDL-C)以及血糖(glucose，GLU)水平存在显著性差异。相比于C1SLs小鼠，B6小鼠表现出相对低水平的GLU、CHOL、HDL-C和LDL-C含量，以及相对高水平的TG含量，并且不同的C1SLs间也展现出多样的血脂及血糖表型的差异。通过各个小鼠品系的肝脏转录组基因表达水平的检测，利用加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis，WGCNA)的方法，我们鉴定了8个与血脂和血糖水平相关的基因模块。在这些模块中，模块M19(83个基因)与所有的五个性状都显著相关，模块M7(491基因)、M8(311基因)、M12(247基因)与GLU水平显著相关，模块M1(930基因)、M14(99基因)、M20(389基因)、M21(117基因)与TG水平显著相关。进一步联合人类全基因组关联分析，揭示了48个调节血脂或血糖的候选基因。此外，我们在1号染色体上发现了38个与血脂和血糖代谢相关的基因，其中13个在小鼠模型中为已报道的功能基因，25个为新发现的血脂及血糖异常候选基因。这些结果表明，C1SLs是用于研究复杂性状理想的小鼠模型。
第二部分：肢体发育缺陷小鼠相关基因的定位克隆及功能研究。我们在构建我国25个不同地区野生来源1号染色体替换小鼠群体的过程中，发现其中广西大新地区来源的小鼠替换系群体中出现不同程度后肢发育缺陷小鼠，通过对肢体缺陷小鼠的全基因组测序，我们成功将性状相关区段定位到8号染色体68.3Mb-73.3Mb区段内。通过肢体缺陷小鼠候选区段内的遗传变异的功能注释，发现有27个基因的SNP存在显著影响基因功能的突变。通过筛选胚胎后肢表达数据库，发现候选区段中有15个基因在胚芽组织中有表达。通过筛选小鼠SNP数据库，发现9个基因的SNP存在于常见的近交系小鼠中，剩下6个基因作为后续研究的候选基因。通过RNA-seq技术检测肢体发育缺陷小鼠与正常对照小鼠的肢芽表达谱，我们发现候选基因Pbx4在肢体发育缺陷小鼠中表达量存在明显的下降，我们将Pbx4基因作为肢体发育相关基因进行功能研究。Pbx4基因是编码前B细胞白血病转录因子家族的成员，它编码的蛋白质含有同源框DNA结合结构域，作为HOX蛋白重要的辅助因子，在胚胎发育和细胞分化中都起到关键作用。利用C3H/10T1/2小鼠间充质细胞模型，过表达Pbx4基因检测肢体发育相关基因表达变化。当Pbx4基因过表达33.7倍时，Hoxc4、Hoxc5、Hoxd8、Fgf4、Shh、Tbx5和Wnt5a基因上升明显(5-30倍)，而Hoxa7、Hoxb2、Hoxb8、Hoxc10、Hoxd10、Fgf10、Pitx1和Wnt4基因拥有轻微的表达量上升(2-5倍)。这说明Pbx4基因对C3H/10T1/2细胞中肢体发育相关基因表达起着明显的促进作用。构建基于CRISPR/Cas9系统的Pbx4基因敲除小鼠模型联合化学物质N-甲基-N’-硝基-N-甲基亚硝基胍(MNNG)诱导用药，在小鼠肢体发育时期E11.5天，对实验组Pbx4(+/-)自交孕鼠和对照组B6孕鼠腹腔注射200mg/kg剂量的MNNG，发现野生型小鼠与基因敲除小鼠肢体发育缺陷的比例存在明显差异。Pbx4杂合敲除小鼠和纯合敲除小鼠有一半比例的小鼠表现出肢体发育缺陷，而野生型小鼠中没有出现肢体缺陷小鼠，结果表明Pbx4基因参与了胚胎肢体发育过程。
经典近交系小鼠在复杂性状遗传学研究中面临挑战，本论文利用野生小家鼠1号染色体替换群体，研究血脂血糖代谢的调控基因以及肢体发育相关基因。结果显示，野生小家鼠1号染色体替换群体存在丰富的遗传及表型多样性，为遗传学研究提供了新的小鼠资源，是研究复杂性状及定位克隆相关功能基因理想的动物模型。
第一部分：利用肝脏表达谱筛选C1SLs中血脂异常的候选基因。小鼠1号染色体上含有大量与血脂代谢相关的QTL，但是许多血脂代谢基因仍未被定位克隆。我们构建的野生小鼠来源1号染色体替换系群体(C1SLs)，除了1号染色体不同外，其他染色体均与B6小鼠相同。因此，C1SLs和B6之间的表型差异都可以推断源于1号染色体的差异。我们检测了13个C1SLs小鼠(1号染色体分别来自于上海嘉定、浙江杭州、上海崇明、山东临沂、云南昆明、山东枣庄1、山东枣庄2、河南三门峡、浙江八里店、上海松江、江苏天王、广西大新和上海杨浦)及B6小鼠中的血脂和血糖水平，发现C1SLs小鼠和B6小鼠的总胆固醇(total cholesterol，CHOL)、甘油三酯(triglyceride， TG )、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol ， HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol， LDL-C)以及血糖(glucose，GLU)水平存在显著性差异。相比于C1SLs小鼠，B6小鼠表现出相对低水平的GLU、CHOL、HDL-C和LDL-C含量，以及相对高水平的TG含量，并且不同的C1SLs间也展现出多样的血脂及血糖表型的差异。通过各个小鼠品系的肝脏转录组基因表达水平的检测，利用加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis，WGCNA)的方法，我们鉴定了8个与血脂和血糖水平相关的基因模块。在这些模块中，模块M19(83个基因)与所有的五个性状都显著相关，模块M7(491基因)、M8(311基因)、M12(247基因)与GLU水平显著相关，模块M1(930基因)、M14(99基因)、M20(389基因)、M21(117基因)与TG水平显著相关。进一步联合人类全基因组关联分析，揭示了48个调节血脂或血糖的候选基因。此外，我们在1号染色体上发现了38个与血脂和血糖代谢相关的基因，其中13个在小鼠模型中为已报道的功能基因，25个为新发现的血脂及血糖异常候选基因。这些结果表明，C1SLs是用于研究复杂性状理想的小鼠模型。
第二部分：肢体发育缺陷小鼠相关基因的定位克隆及功能研究。我们在构建我国25个不同地区野生来源1号染色体替换小鼠群体的过程中，发现其中广西大新地区来源的小鼠替换系群体中出现不同程度后肢发育缺陷小鼠，通过对肢体缺陷小鼠的全基因组测序，我们成功将性状相关区段定位到8号染色体68.3Mb-73.3Mb区段内。通过肢体缺陷小鼠候选区段内的遗传变异的功能注释，发现有27个基因的SNP存在显著影响基因功能的突变。通过筛选胚胎后肢表达数据库，发现候选区段中有15个基因在胚芽组织中有表达。通过筛选小鼠SNP数据库，发现9个基因的SNP存在于常见的近交系小鼠中，剩下6个基因作为后续研究的候选基因。通过RNA-seq技术检测肢体发育缺陷小鼠与正常对照小鼠的肢芽表达谱，我们发现候选基因Pbx4在肢体发育缺陷小鼠中表达量存在明显的下降，我们将Pbx4基因作为肢体发育相关基因进行功能研究。Pbx4基因是编码前B细胞白血病转录因子家族的成员，它编码的蛋白质含有同源框DNA结合结构域，作为HOX蛋白重要的辅助因子，在胚胎发育和细胞分化中都起到关键作用。利用C3H/10T1/2小鼠间充质细胞模型，过表达Pbx4基因检测肢体发育相关基因表达变化。当Pbx4基因过表达33.7倍时，Hoxc4、Hoxc5、Hoxd8、Fgf4、Shh、Tbx5和Wnt5a基因上升明显(5-30倍)，而Hoxa7、Hoxb2、Hoxb8、Hoxc10、Hoxd10、Fgf10、Pitx1和Wnt4基因拥有轻微的表达量上升(2-5倍)。这说明Pbx4基因对C3H/10T1/2细胞中肢体发育相关基因表达起着明显的促进作用。构建基于CRISPR/Cas9系统的Pbx4基因敲除小鼠模型联合化学物质N-甲基-N’-硝基-N-甲基亚硝基胍(MNNG)诱导用药，在小鼠肢体发育时期E11.5天，对实验组Pbx4(+/-)自交孕鼠和对照组B6孕鼠腹腔注射200mg/kg剂量的MNNG，发现野生型小鼠与基因敲除小鼠肢体发育缺陷的比例存在明显差异。Pbx4杂合敲除小鼠和纯合敲除小鼠有一半比例的小鼠表现出肢体发育缺陷，而野生型小鼠中没有出现肢体缺陷小鼠，结果表明Pbx4基因参与了胚胎肢体发育过程。
经典近交系小鼠在复杂性状遗传学研究中面临挑战，本论文利用野生小家鼠1号染色体替换群体，研究血脂血糖代谢的调控基因以及肢体发育相关基因。结果显示，野生小家鼠1号染色体替换群体存在丰富的遗传及表型多样性，为遗传学研究提供了新的小鼠资源，是研究复杂性状及定位克隆相关功能基因理想的动物模型。