内质网(endoplasmic reticulum,ER)是真核细胞蛋白质合成、折叠、组装与分泌的主要场所,也是脂质代谢、糖类代谢、钙离子储存等细胞内重要生理过程发生的关键细胞器。内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)是指在能量或营养缺乏、缺氧、钙离子紊乱、氧化应激、糖基化抑制、病毒感染等内源或外源因素的刺激下,细胞内环境稳态被破坏,使蛋白质加工运输受阻,错误折叠或未折叠蛋白在内质网腔内累积,内质网的形态和功能受损,引发细胞采取相应的应答反应,以促进内质网功能恢复。未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)是细胞内最重要的内质网应激反应,目前对其信号通路的了解已经较为深入。细胞内UPR的激活和信号转导主要经由内质网膜上的三个跨膜蛋白IRE1α、PERK和ATF6所介导,它们也被称为内质网应激感受器(ER stress sensors)。在非应激状态下,这三种感应蛋白的内质网腔内段与位于内质网内的分子伴侣蛋白GRP78(glucose-regulated protein of 78kDa)/BIP(immunoglobulin-binding protein)结合而处于失活状态;而当内质网处于应激状态时,未折叠或错误折叠的蛋白质竞争结合BIP,使BIP脱离UPR信号感应蛋白,从而激活三条经典的UPR信号通路。适度的内质网应激通过UPR启动一系列下游靶基因的表达,协同发挥作用,减少蛋白质合成,促进蛋白质折叠和降解,从而恢复内质网的稳态与功能。持续或过强的ERS则通过UPR信号通路导致细胞功能紊乱或细胞凋亡。大量研究证实,ERS/UPR异常在代谢相关疾病、肿瘤等多种疾病的发生和发展中具有重要作用。然而目前关于ERS/UPR调控的分子机制及其功能效应远未阐明。人源的NDRG2(N-Myc Downstream Regulated Gene 2)是本研究组首次报道的新抑癌基因。它属于NDRG家族成员,该家族由NDRG1-4四个成员组成。近年来我们和其他实验室的研究发现:NDRG2在多种肿瘤组织中表达降低,在肿瘤细胞系中过表达该基因可抑制细胞的各种恶性生物学行为,包括细胞增殖、侵袭、凋亡抵抗、放化疗敏感性、代谢重编程、EMT等等。NDRG2在缺氧、DNA损伤药物、组织缺血再灌注、温度变化、脂毒性物质及炎症作用等条件下亦参与细胞应激反应。这些研究表明NDRG2既是抑癌基因,也是应激反应基因。但NDRG2是否参与ERS/UPR及相关生理病理过程尚未见报道。因此本研究拟探讨NDRG2是否参与ERS/UPR及其介导的细胞凋亡和肝脂代谢过程。首先,我们以肝癌细胞系SK-Hep-1为研究对象,应用经典ERS诱导剂毒胡萝卜素Tg或衣霉素Tm处理细胞不同时间,Western blot和Real-time PCR检测ERS/UPR标志性分子和NDRG2的表达变化。结果发现NDRG2伴随着这些分子的变化而上调,说明内质网应激可诱导NDRG2表达,提示NDRG2参与ERS/UPR过程。为明确NDRG2如何参与和调控ERS/UPR,我们建立了稳定过表达NDRG2的SK-Hep-1细胞系和稳定过表达Cherry的对照细胞,施以Tg/Tm刺激后采用Western blot和Real-time PCR检测UPR关键分子,结果提示NDRG2主要作用于UPR三个分支中的PERK支路,促进其下游靶基因ATF4和CHOP表达上调。因此,NDRG2可能作为一个新的UPR调节分子,增强PERK通路,从而参与UPR。为进一步证实上述结论,我们以Ndrg2敲除和野生型小鼠为研究对象,分别施以正常饲喂、高脂饲喂和Tm腹腔注射建立ERS体内模型,对比检测了两种基因型小鼠肝组织ERS标志性分子及UPR信号。Western blot和Real-time PCR检测结果显示,Ndrg2 KO小鼠肝组织在基础水平时Perk支路下游的Atf4、Chop较野生型小鼠略有降低,而在高脂饲喂和Tm腹腔注射处理后,Atf4、Chop下调更明显。表明Ndrg2缺失导致UPR反应减弱。PERK支路下游ATF4/CHOP是ERS诱发细胞凋亡的关键分子,因此我们考察了NDRG2调控PERK通路对细胞命运的影响。以Tg和Tm刺激细胞,流式细胞仪检测发现NDRG2过表达可以明显促进Tg/Tm诱发的SK-Hep-1细胞凋亡;而利用siRNA敲减NDRG2过表达细胞中的ATF4和CHOP时,Tg/Tm诱导的凋亡效应明显削弱。小鼠体内实验也表明,Ndrg2 KO小鼠腹腔注射Tm后肝组织中TUNEL阳性的凋亡细胞数较WT明显减少。这些研究表明NDRG2通过增强PERK-ATF4-CHOP通路,促进ERS所诱导的凋亡反应。文献报道ERS/UPR可通过直接或间接的方式参与肝脂代谢调节,因此我们初步探讨了NDRG2对肝脂代谢的影响。通过检测野生型和Ndrg2 KO小鼠的肝脂,发现KO小鼠肝组织油红染色表现出明显的脂质沉积,肝甘油三酯含量明显增加。对野生型和Ndrg2 KO小鼠肝组织进行脂代谢相关基因PCR检测,发现KO肝组织Pgc1α表达较WT降低,其他均无一致性的变化(图4-2)。NDRG2对肝脂质代谢的调节作用仍待深入研究。综上所述,NDRG2是一个新的内质网应激反应分子,参与细胞中内质网应激反应,并且在ERS诱导的细胞凋亡中发挥着重要作用。上述研究不仅揭示了NDRG2的新功能,而且丰富了UPR信号通路的调控机制。