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[研究背景与目的]肿瘤患者体内凝血-抗凝系统平衡被打破,血液呈“浓、黏、凝、聚”状态,血瘀的状态伴随着肿瘤发生、发展的病理生理过程。机体高凝状态下外周血中免疫抑制因子TGF-β1含量显著增多,其能够多途径抑制机体自然杀伤(NK)细胞介导的肿瘤免疫,促进肿瘤的发生与发展。针对机体高凝状态,临床多采用活血化瘀中药丹参来改善外周血高凝状态,增强机体免疫。本研究采用活血化瘀中药丹参代表成分丹参素进行研究,探讨其对TGF-β1抑制NK细胞杀伤乳腺癌作用的影响。[研究内容与结果]1.本研究首先运用人源非霍奇金性淋巴瘤患者NK细胞NK92MI、人源乳腺癌细胞ZR-75-1,探讨NK92MI细胞对ZR-75-1细胞的杀伤效应,以及TGF-βi对这一过程的干预作用,发现丹参素在不同效靶比下均能够浓度依赖性逆转TGF-βi对NK92MI杀伤乳腺癌细胞ZR-75-1的抑制作用。2.确定丹参素体外逆转TGF-βi对NK92MI细胞杀伤效应作用的药物剂量,采用正反向实验观察TGF-β1对NKG2DL-NKG2D信号轴的影响,以及丹参素对这一过程的纠正作用。3.采用Western Blot、RT-PCR以及免疫荧光实验探讨丹参素对人源乳腺癌细胞ZR-75-1表面NKG2DL表达的影响,实验结果表明TGF-βi能够显著下调NKG2DL的表达水平,不同剂量的丹参素能够加以纠正。4.采用Western Blot、RT-PCR以及免疫荧光实验探讨丹参素对NK92MI细胞表面NKG2D及其分子伴侣DAP10的转录和蛋白水平的影响,研究表明不同剂量的丹参素能够逆转TGF-β1所介导的对NKG2D/DAP10表达的抑制水平。5.通过Western Blot、免疫荧光实验以及采用激光共聚焦3D成像技术观测NK92MI细胞重要转录因子β-smad2/3的表达和入核情况,结果显示丹参素能够显著逆转TGF-β1所介导的β-smad2/3表达下调及入核减少的情况,说明丹参素能够通过调控其蛋白表达及核移位从而调控下游细胞免疫杀伤相关信号通路。6.采用免疫共沉淀co-IP及免疫荧光技术考察NK细胞表面NKG2D-DAP10复合物的形成情况,实验结果表明,丹参素能够逆转TGF-β1对NKG2D-DAP10结合的抑制作用,恢复两者相互作用。7.通过Western Blot考察NK细胞杀伤介质释放相关信号通路PI3K-ERK1/2-PLC y2的激活,结果显示TGF-β1能够显著下调该信号通路表达水平,给予不同剂量丹参素后能够加以逆转。8.通过流式细胞术考察NK细胞表面脱颗粒指标CD107a表达,丹参素能够改善TGF-β1对NK细胞表面CD107a表达下调的情况,促使NK细胞脱颗粒从而发挥免疫杀伤作用。9.采用胞内因子染色结合流式细胞术检测NK92MI细胞脱颗粒相关指标,发现TGF-β1能够显著抑制穿孔素(Perforin),颗粒酶B(Granzyme B)及干扰素γ(IFN-γ)的胞内表达水平,同时通过RT-PCR及ELISA实验发现,丹参素能够逆转TGF-β1所介导的杀伤介质合成和释放,从而加强NK细胞对肿瘤细胞的免疫杀伤作用。[结论与意义]基于以上结果,我们发现:TGF-β1能够破坏NKG2DL-NKG2D信号轴,分别下调两者表达水平,影响β-smad2/3表达及入核,抑制NK细胞脱颗粒环节关键信号通路PI3K-ERK1/2-PLC y2活化以及NK细胞脱颗粒标志物CD107a表达,进而影响NK细胞抗肿瘤细胞毒性杀伤介质释放。而丹参素能够干预TGF-β1对NK细胞的负向调控作用,主要通过促进NKG2D及其分子伴侣DAP10的表达并促进NKG2D-DAP10复合物形成,致使NK细胞激活并释放各类杀伤介质从而恢复对肿瘤细胞的免疫攻击。本课题确证了肿瘤患者外周血高凝状态下大量释放的免疫抑制因子TGF-β1能够抑制NK细胞的抗肿瘤免疫功能,而丹参素作为活血化瘀中药的代表,从机体固有免疫角度逆转TGF-β1对NK细胞的免疫抑制作用,恢复机体免疫,抑制肿瘤的发生发展。