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狂犬病是由狂犬病毒(Rabies virus,RABV)引起的一种急性传染病,人兽共患,一旦发病,病死率几乎为100%。控制人间狂犬病传播最有效的手段是切断传染源头,控制动物间狂犬病的传播,其防控难点在于流浪动物和野生动物的免疫。因此,急需研发不依赖于注射接种,适用于大规模免疫的口服疫苗。乳酸菌是公认安全的益生菌,对肠道的不利环境具有良好的耐受性,并且重组乳酸菌表达的蛋白无需进行纯化可大规模生产。本研究以乳酸菌为表达载体,狂犬病毒糖蛋白(GP)为候选抗原,构建表达狂犬病毒糖蛋白的重组乳酸菌作为新型口服疫苗,通过体内外试验评价其作为新型口服疫苗的潜力,以期为狂犬病口服疫苗的研制提供一种新的策略。1、根据Genbank载入的狂犬病毒基因序列,合成狂犬病病毒糖蛋白主要抗原表位区基因RVG,通过PCR方法在其C’端融合特异性树突状细胞靶向肽(DCpep)编码基因后插入到乳酸菌表达载体中,以融合无关肽(ctrl)编码基因为对照,分别构建表达RVG基因的重组乳酸菌NC8-pgsA’-RVG-DCpep和NC8-pgsA’-RVG-ctrl。通过Western-blot和免疫荧光进行蛋白水平检测,结果显示狂犬病毒糖蛋白成功表达在乳酸菌表面。将重组乳酸菌以口服方式免疫小鼠,评价其免疫原性,通过流式细胞术和ELISA方法进行检测。结果显示,两株重组乳酸菌均具有免疫原性,但与重组乳酸菌NC8-pgsA’-RVG-ctrl相比,重组乳酸菌NC8-pgsA’-RVG-DCpep能够诱导活化更多的CD11c~+CD80~+DC细胞和B220~+IgA~+B细胞,提高肠道内sIgA和血清IgG分泌量。表明,重组乳酸菌NC8-pgsA’-RVG-DCpep具有更强的免疫原性。2、本研究中分别构建了胞内表达型和表面展示型两种含双拷贝糖蛋白(GP)基因重组乳酸菌,命名为NC8-pSIP-dRVG与NC8-pgsa-dRVG,以期通过提高抗原蛋白表达量,达到提高免疫效果的目的。经Western-blot和免疫荧光鉴定结果表明,与含单拷贝GP基因重组乳酸菌相比,含双拷贝GP基因重组乳酸菌产生糖蛋白的量更高,并且胞内表达含双拷贝GP基因重组乳酸菌NC8-pSIP-dRVG表达GP蛋白的量显著高于表面展示含双拷贝GP基因重组乳酸菌NC8-pgsa-dRVG。3、通过口服免疫小鼠,评价含双拷贝GP重组乳酸菌的免疫保护效果。小鼠免疫实验中,含单拷贝GP基因重组乳酸菌和含双拷贝GP基因重组乳酸菌均具有免疫原性,但与含单拷贝GP基因重组乳酸菌相比,含双拷贝GP基因重组乳酸菌能够诱导产生更高水平的糖蛋白特异性抗体、IgG和sIgA,并且提高血清中细胞因子IFN-γ、IL-17A、IL-4的分泌量;含双拷贝GP基因重组乳酸菌免疫后能够活化或募集更多的树突状细胞(dendritic cell,DC),并且诱导产生显著增多的分泌IFN-γ或IL-4的CD4+T和CD8+T细胞。其中胞内表达型含双拷贝GP基因重组乳酸菌NC8-pSIP-dRVG诱导产生的免疫效果优于表面展示型含双拷贝GP基因重组乳酸菌NC8-pgsa-dRVG。在RABV致死性攻击下,胞内表达型含双拷贝GP基因重组乳酸菌NC8-pSIP-dRVG对小鼠的保护率显著高于表面展示型含双拷贝GP基因重组乳酸菌NC8-pgsa-dRVG,可达到60%,与商品灭活疫苗单次免疫保护率相当。因此,胞内表达型含双拷贝GP基因重组乳酸菌NC8-pSIP-dRVG,具有成为新型狂犬口服疫苗的潜力,为狂犬病毒口服疫苗的研制提供一种新的策略。