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布鲁克斯皮格勒综合征(Brooke-Spiegler syndrome,BSS)是一种罕见疾病,是病变发生在皮肤及皮肤附属器上的综合征,大多数病人在成年初期开始长出肿瘤,多见于头颈部。这种综合征通常可以发展成肿瘤,比较常见的有螺旋腺瘤、多发性毛发上皮瘤以及圆柱瘤,这些肿瘤通常是良性的,但是肿瘤会随着时间越长越大,越长越多,从而导致毁容并影响五官的功能。目前已有报导明确指出圆柱瘤基因(cylindromatosis,CYLD)的突变会导致圆柱瘤等皮肤附属器肿瘤的发生,但其具体调控分子机制仍缺乏深入研究和明确报道。CYLD基因是一种肿瘤抑制因子,该基因缺失或突变将会导致圆柱瘤的发生,同时在其他肿瘤如肝癌,乳腺癌,宫颈癌中也发现了CYLD低表达现象。该基因编码的蛋白CYLD是USP家族(ubiquitin-specific proteases,泛素特异性蛋白酶)成员,具有去泛素化酶活性。CYLD可以与底物蛋白发生相互作用并进行识别,切除识别的底物蛋白上通过63位赖氨酸(K63)连接的泛素链,调控底物蛋白的功能,从而调控多条信号通路,如NF-?B(Nuclear factor-κB)、JNK(c-Jun N-terminal kinase)、Wnt(Wingless-INT)等信号通路。去泛素化酶CYLD对底物蛋白的去泛素化修饰是依赖于其与底物的相互作用,因此我们推测CYLD发生点突变或截短突变后,导致某些相互作用的得到或者失去从而导致肿瘤的发生。邻近蛋白标记技术(Proximity-dependent biotin identification,Bio ID)是最近发展起来的一种方法,它可以识别活细胞中目的蛋白质邻近的蛋白质。目的蛋白与生物素(Biotin)连接酶Bir A*突变体进行融合形成融合蛋白,Bir A*能够非特异性地生物素化其10 nm范围内邻近的蛋白质。这些邻近的蛋白可以直接或间接地与融合蛋白相互作用,或者位于相同的亚细胞邻近区域。链霉亲和素与生物素具有极强的亲和力,生物素化修饰的蛋白质可以通过与链霉亲和素结合从细胞提取物中纯化,最后通过质谱法鉴定。本研究中,我们首先验证Bir A*融合的CYLD蛋白的定位和功能与CYLD蛋白有没有差异,发现Bir A*-CYLD融合蛋白与CYLD蛋白相比,亚细胞定位没有发生变化,但去泛素化功能会受到影响。然后我们利用Bio ID技术鉴定野生型、酶活突变型、截短突变体(1-471 a.a)的CYLD蛋白的邻近蛋白,质谱鉴定发现点突变和截短突变后可以获得更多的相互作用,尤其截短突变后获得相互作用显著增加。对截短突变体(1-471 a.a)的CYLD差异互作蛋白进行定位和功能分析发现截短突变体(1-471a.a)的CYLD差异互作蛋白的定位与该截短体的定位是一致的,而对这些相互作用分子的功能分析中,除了已知功能,还发现了一个新的功能:与Hippo信号通路相关。在这些Hippo通路相关分子中,我们筛选出了三个Hippo信号通路的分子:YAP(yes associated protein,yes相关蛋白)、LIMD1(LIM domain-containing protein 1,LIM结构域蛋白1)、AMOT(angiomotin,血管生成抑制素结合蛋白)。随后,我们对这三个分子进行相互作用验证,发现CYLD蛋白只与LIMD1发生相互作用,并对LIMD1进行去泛素化修饰。Hippo通路主要功能是控制组织器官大小、调节细胞增殖、凋亡。该通路包括一系列激酶级联反应、转录辅激活因子和转录因子。转录辅激活因子YAP的活性受到上游激酶级联反应的控制。当Hippo通路被激活时,级联激酶反应被激活,YAP蛋白发生磷酸化,磷酸化的YAP(p YAP)被滞留在细胞质中,一部分被泛素化修饰而发生降解。而当Hippo通路失活后,YAP不能被磷酸化,进而进入到细胞核内,与核内TEAD(Transcription enhancer factor,转录增强因子)家族成员结合后启动促进细胞增殖和生长的基因表达。而AMOT和LIMD1是Hippo通路的上游调控分子,根据报导LIMD1可以负调控Hippo通路,我们通过实验发现过表达LIMD1可以抑制YAP蛋白127位丝氨酸发生磷酸化。有文献报道在果蝇中,CYLD在细胞质中与Hippo通路中的激酶结合而共定位,并通过限制该激酶的磷酸化来降低其活性,从而增加Hippo通路下游关键效应蛋白Yki/YAP在核内积累,促进细胞增殖。所以我们推测CYLD可能通过其去泛素化酶的功能来调控Hippo通路的活性,从而抑制肿瘤的发生。本研究中,我们发现在HEK293(人胚胎肾细胞293)细胞中,过表达CYLD对YAP磷酸化水平以及核定位没有明显影响,但敲低CYLD会使YAP的磷酸化水平下降,细胞核定位增多,同时YAP下游靶基因水平上升,说明敲低CYLD会导致Hippo信号通路活性下降。总之,本研究首次通过邻近标记蛋白质组学实验发现了CYLD与Hippo通路分子具有相互作用,并且进一步对Hippo通路相关分子LIMD1进行去泛素化修饰。并且CYLD可以调控Hippo通路的活性,CYLD低表达会使YAP的磷酸化水平下降,细胞核定位增多,同时YAP下游靶基因水平上升,导致Hippo信号通路活性下降。根据已有结果我们推测CYLD可能通过对LIMD1的去泛素化修饰来调控Hippo通路活性,从而抑制肿瘤的发生。