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大肠埃希氏菌(Escherichia coli)是肠道菌群中重要的食源性条件致病菌之一。Oqx AB外排泵是RND(Resistance-nodulation-cell division)外排泵家族重要组成之一,对包括恩诺沙星、环丙沙星、喹乙醇和氯霉素等多种抗菌药、金属离子以及某些季铵盐类消毒剂都具有外排作用,是大肠杆菌重要的可转移抗性机制之一。目前关于质粒介导的oqx AB基因在大肠杆菌间的转移条件以及接合子的表型和基因型变化的基础研究较少。基于以上现状,本课题以临床分离的oqx AB基因阳性的鸡源大肠杆菌C26和链霉素抗性标记的工程菌大肠杆菌C600分别作为供体菌及受体菌,研究不同浓度的恩诺沙星、喹乙醇和氯霉素作为诱导底物以及不同供受体菌比例对oqx AB基因在大肠杆菌间转移的影响,并借助高通量测序手段对接合子大肠杆菌C26-600(M1)进行质粒序列分析和对大肠杆菌C600和接合子大肠杆菌C26-600(M1)转录组学研究,旨在探究影响大肠杆菌中oqx AB基因转移的条件以及转移发生后接合子的稳定性调节、生长力及耐药表型的变化规律。1鸡大肠杆菌中oqx AB基因流行性调查及细菌耐药表型研究2019年从安徽及江西地区分离的200株临床鸡源大肠杆菌进行oqx AB基因检测:对其中32株oqx AB基因阳性的大肠杆菌进行氨苄西林等16种抗菌药的药物敏感性测试,按照CLSI(M100)文件的标准进行耐药判定。结果显示,200株临床大肠杆菌中的oqx AB基因阳性率为18.5%(37/200);32株oqx AB基因阳性大肠杆菌中,耐药率最高的为氨苄西林、大观霉素、四环素、氟苯尼考、磺胺异恶唑等5种药,均达85%以上;而耐药率低于20%的几种药为复方新诺明、头孢他啶、美罗培南、粘杆菌素和乙酰甲喹。同时,oqx AB基因阳性的大肠杆菌常呈多重耐药,5重、10重、12重耐药的菌株分别达84%(27/32)、37%(12/32)及9%(3/32)。2不同条件对大肠杆菌中oqx AB基因转移的影响的研究大肠杆菌C600作为接合转移试验的受体菌,大肠杆菌C15、C16、C26和C27作为接合转移预试验的供体菌。根据预实验结果,选取大肠杆菌C26作为接合转移试验的供体菌。接合转移试验以3种抗菌药诱导物(恩诺沙星、喹乙醇、氯霉素)、以受体菌大肠杆菌C600对相应抗菌药的MIC设置的6种诱导浓度(0 MIC、1/32 MIC、1/16MIC、1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC)及3种供受体菌接合比例[(10~8CFU/m L:10~5CFU/m L)、(10~5CFU/m L:10~5CFU/m L)、(10~2CFU/m L:10~5CFU/m L)]为基础交叉设置条件。3种抗菌药诱导结果显示,oqx AB基因在大肠杆菌中的转移受到氯霉素的调节作用最小,喹乙醇对其转移的促进作用最为明显。不同浓度诱导结果显示,3种抗菌药随诱导浓度升高接合率先升高后下降,在1/8MIC～1/4MIC处的接合率最高。不同供受体菌接合比例的诱导结果显示,供受体菌比例从1000:1、1:1、1:1000逐渐降低时,接合率逐渐降低。3接合子稳定性、耐药表型和生长力分析10株接合子(M1～M10)进行无抗LB肉汤(除含有链霉素)培养,测定接合子菌液中耐药菌比值;检测接合子M1的耐药表型变化;测定接合子M1的生长曲线。接合子稳定性验证结果显示,10株接合子在无抗LB肉汤(除含有链霉素)中传代10天后耐药菌比值范围为24.81%～94.81%,接合子M1(69.57%)作为后续试验菌株。接合子M1的药敏试验结果显示:相比受体菌,接合子对氨苄西林、庆大霉素、四环素、氟苯尼考、复方新诺明、头孢他啶、恩诺沙星、氧氟沙星、喹乙醇、氯霉素等10种抗菌药的耐药水平提升16倍以上,同时对大观霉素、头孢噻呋和安普霉素的耐药水平也有4倍以上的提升;相比供体菌,接合子对头孢他啶、安普霉素和氧氟沙星的耐药水平也有4倍及以上的提升。接合子M1生长曲线测定结果显示,与受体菌相比生长速率受到抑制,细菌终浓度与供体菌相近。4接合子质粒的基因组测序分析接合转移试验中接合子大肠杆菌C26-600(M1)进行质粒基因组测序分析。结果表明大肠杆菌C26-600(M1)的质粒类型为Inc X型,大小为138,728 bp。接合子大肠杆菌C26-600(M1)中质粒介导的耐药背景除喹诺酮类(oqx A/oqx B)外,还包括β-内酰胺类(bla TEM-1、bla TXM-55)、氨基糖苷类(aad A5)、氯霉素类(cm LA、flo R、cat B3)、季铵盐类(qac E11)、磷霉素(fos A3)及利福平(arr-3)。5.接合子和受体菌的比较转录组学测序分析接合转移试验中受体菌大肠杆菌C600和接合子大肠杆菌C26-600(M1)进行比较转录组测序分析。筛选出与多药外排泵相关的差异表达基因,主要包括RND家族(acr F、acr R)和MFS家族(emr Y、mdt G、emr D、mdf A)。适应及稳定性相关的差异表达基因主要包括hip A、hip B及umu D,参与维持接合子大肠杆菌C26-600(M1)中质粒的稳定。毒素-抗毒素(Toxin-Antitoxin,TA)系统相关差异表达基因主要包括yaf N、hok E、hok B、hok D、mqs R、rel B及mqs A。本课题首次研究了抗菌药底物、抗菌药浓度以及细菌不同接合比例对oqx AB基因在大肠杆菌中转移的影响,证实了不同抗菌药种类和浓度及不同供受体菌接合比例均会对大肠杆菌中oqx AB基因的转移产生影响。本研究对临床oqx AB基因耐药传播的风险评估和制定临床耐药防控措施具有重要的理论意义。