第一部分Sidt2基因敲除小鼠的繁育及其肝脏表型研究目的繁育Sidt2基因敲除小鼠并研究其肝脏表型方法(1)根据上海南方模式生物中心提供的基因敲除小鼠繁殖方案,以Sidt2(+/-)基因型小鼠作为种鼠,杂合型小鼠交配获得Sidt2(-/-)模型小鼠和Sidt2(+/+)对照小鼠。在小鼠15日龄时提取小鼠尾尖DNA,PCR鉴定小鼠基因型。(2)Realtime PCR检测小鼠肝脏组织Sidt2基因m RNA水平表达情况。免疫组化和Western blot检测小鼠肝脏组织Sidt2蛋白水平表达情况。结果DNA和RNA水平显示Sidt2基因敲除小鼠第二外显子被敲除;Western blot和免疫组化显示,野生型小鼠肝脏Sidt2表达量很高,在基因敲除小鼠肝脏中Sidt2蛋白被完全敲除。结论成功繁殖获得Sidt2基因敲除小鼠以满足后续试验需要。第二部分Sidt2基因敲除小鼠对小鼠肝脏基因转录组的影响目的研究Sidt2基因敲除小鼠肝脏基因转录组的变化以及对肝脏脂质代谢的影响方法(1)选取1月龄,3月龄,6月龄Sidt2基因敲除小鼠和同笼出生同年龄野生型对照鼠各一只,使用Affymetrix小鼠基因组430 2.0芯片检测3个年龄段小鼠肝脏基因转录组差异。根据信号强度值相差2倍以上这一评判标准筛选出差异表达基因。(2)Realtime PCR验证表达谱芯片结果。(3)在Sidt2基因敲除小鼠及野生型对照小鼠8周龄大小时开始进行高脂喂养,检测高脂前后实验组和对照组小鼠血脂水平(4)Western blot检测Sidt2基因敲除小鼠高脂前后leptin受体蛋白及其下游通路蛋白的表达。结果(1)表达谱芯片检测:提取的RNA经甲醛变性凝胶电泳显示无降解,纯度好。应用Affymetrix小鼠表达谱芯片进行杂交分析,Sidt2基因敲除小鼠和野生型小鼠的差异表达基因为,三个年龄段共表达且FC>2的差异基因共有76个,其中,有12个和脂质代谢通路有相关关系,有15个和自噬、凋亡通路有相关关系。(2)Realtime PCR检测差异基因表达变化趋势与表达谱芯片结果相一致。(3)高脂饮食前后测定的血脂结果均显示两组小鼠TG有显著统计学差异。(4)Sidt2基因敲除小鼠leptin受体蛋白表达增加,并激活JAK-STAT通路,引起磷酸化stat3蛋白表达增加。结论Sidt2基因敲除可引起小鼠脂质代谢紊乱,引起血清TG升高。这一效应可能是由于Sidt2对JAK-STAT通路的影响实现的。