脑胶质瘤是严重危害人类健康的常见肿瘤，致残、致死率较高。尽管采用了手术、放疗和化疗等多种治疗措施，但患者的预后仍不够理想。近年来，免疫治疗逐渐成为新的研究热点，并有望作为一类新的治疗方法。然而， 目前免疫治疗的受限点是难以获得特异性抗体。由于现有抗体的异源性，这给临床应用带来了不便，故制备新的特异性人源性抗体便成为了急需解决的问题。噬菌体抗体库技术作为基因工程抗体制备的代表技术，避开了以杂交瘤技术制备抗体的繁杂步骤，为高效生产抗体提供了一个新的途径。我们利用该项技术成功地构建了人源性胶质瘤噬菌体抗体库，并进行了初步筛选。 1．抗体库的建立 应用免疫组化和ELISA法，筛选出抗胶质瘤自身抗体阳性患者，抽取这些患者的血样(50ml／份)，利用梯度离心法从中分离出淋巴细胞，提取总RNA，逆转录合成cDNA。根据Kabat基因库设计出人抗体基因引物，经巢式PCR扩增出人抗体可变区基因，第一轮扩增出约700bp产物(V_H、Vκ)，第二轮扩增出约320bp(Vκ)和360bp(VH)产物，第三轮扩增出约400bp 第四军匠大学俗士学位论文 （VJ和 400hp（V。）产物c将最后一轮扩增出来的轻、重链基因分别克 隆入载体pUC18，构建成轻、重涟基因库。然后将重链基因克隆入轻链库中， 构建成 2 XIO’单链抗体基因库。从该基因库中获取完整的单链抗体基因，将 其重新克隆入表达载体pDNAS，电转化E．COlt TGI并超感染制备成原始噬 菌体抗体库。此库感染 ECOli BS1365，使单链抗体基因发生重组，并经辅助 噬菌体VCSN413超感染，构建成重组的噬菌体抗体库，测定滴度为3．SX10‘＼ 重组库再感染 E Colt DHS Q F，，继之超感染构建成最终的噬菌体抗体库。 2．抗体库的筛选 将抗体库与胶质瘤细胞系BT325孵育，结合的噬菌体用pH 2．2的盐酸－ 甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，并感染 E．COlt TG进行增殖。为了降低无关噬菌体 的给合，提高信／噪比，在筛选过程中采用竞争结合法，首先将噬菌体抗体库 与胶质瘤细胞结合，然后加入一定量的正常胶质细胞，在悬浮状态下竟争结 合噬菌体抗体。竞争结合后利用贴壁生长特性回收胶质瘤细胞及结合的噬菌 体抗体，再经过梯度洗脱，剔除低亲和力的噬菌体抗体，获得与胶质瘤细胞 有一定结合能力的噬菌体抗体。 3．细胞结合ELISA分析 经过四轮筛选，用胶质瘤细胞结合ELISA检测，有40％的克隆显示阳性， 说明筛选效率较好。进而用正常胶质细胞进行细胞结合ELISA，获得7个克 隆不与正常胶质细胞结合，再继续对此7个克隆进行细胞结合测定，最终获 得3个只与胶质瘤细胞结合，而不与正常胶质细胞结合的。有一定特异性的 克隆。