论文部分内容阅读
目的比较3种方法即超速离心法、超滤法和沉淀法对人尿液来源exosome分离结果的影响,并进一步探究exosome的最佳分离条件。本研究为临床上选择合适的人尿液exosome分离方法提供了参考依据。方法1.采用超速离心法、超滤法及沉淀法分别从20个健康人和10个慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)患者尿液中分离提取exosome;用透射电镜(transmission electron microscope,TEM)观察exosome大小形状,蛋白质印迹法(Western-blot)检测exosome标志蛋白TSG101及Alix以鉴定exosome。2.在尿量及exosome总蛋白量相同情况下,用Western-blot检测3种方法分离提取的尿exosome中标志蛋白,比较不同分离方法分离尿exosome的效果。3.Western-blot检测尿exosome中标志蛋白以分析尿液样本17,000g离心前是否有必要低速离心去除细胞以及不同离心力(100,000g,150,000g,200,000g及250,000g)、离心时间(0.5h,1h及2h)及温度(4℃,25℃及37℃)对超速离心分离尿液exosome结果的影响。结果1.在透射电镜下,3种方法分离的exosome都呈圆形或椭圆形囊泡样结构,直径40-100nm、包膜完整,腔内为均一的低电子密度物质。Western-blot法检测exsome标志蛋白TSG101和Alix,结果显示,超速离心法及超滤法可以检测到exosome标志物TSG101、Alix,而超速离心法上清、超滤法滤液、沉淀法沉淀和上清都未能检测到。2.在尿量相同情况下,3种分离方法获得exosome分别进行蛋白标志物TSG101及Alix检测,Western-blot结果显示超速离心法印迹条带灰度最深,且所有样本均能检测出TSG101及Alix蛋白;超滤法获取的exosome,健康人尿液来源的exosome均能检测出TSG101及Alix蛋白,但在CKD患者均未能检测到;而沉淀法在所有样本均未检测到exosome标志蛋白。调整上样体积使得exosome总蛋白量Western-blot检测3种分离方法得到的exosome中的标志蛋白,结果显示超速离心法分离得到的exosome量最多且在所有样本均能检测到TSG101及Alix蛋白表达;超滤法在20个健康人中有11个人能检测到TSG101及Alix,10个CKD患者未能检测到;而沉淀法在所有样本均未检测到exosome志蛋白。3.Western-blot结果表明,低速离心去除细胞的尿样本及未低速离心去除细胞的尿样本,分离获得的exosome印迹条带灰度无明显差异;超速离心法分离尿液exosome,随着离心力及离心时间的增加,印迹条带灰度逐渐加深,250,000g,2h离心条件下分离获得的exosome印迹条带灰度最深,而不同温度条件下,印迹条带灰度无明显差异。结论较超滤法及沉淀法,超速离心法分离尿液exosome的效率最高,是值得推荐的尿液exosome分离方法。尿液样本17,000g离心前无需低速离心去细胞,超速离心法分离尿液exosome效果在离心力为250,000g及离心时间为2h时分离效果最好,而离心温度对exosome分离无明显影响。