海洋病原微生物严重威胁公众健康,及时、准确地检出病原微生物对于疾病的预防与控制至关重要。虽然基于信号报告的微生物分析方法取得了进展,但低成本、超灵敏和准确的诊断技术仍需要进一步提高。本研究通过基因工程技术获得细菌生存防御系统（MDS,microbial defense system）中行使重要功能的毒素蛋白,探索其作为生物传感器信号放大探针的响应机制,并构建了三种基于功能化毒素蛋白的微生物诊断传感器,为海洋微生物的快速诊断和预警防护研究提供新方向。主要研究内容如下:1、功能化溶血素标记夹心法（HLSA）的微生物诊断机制。HLSA利用纳米孔蛋白质α-溶血素作为新型电信号探针,通过将靶点核酸、磁性捕获探针和溶血素修饰的纳米检测探针结合,组装形成溶血素活化的复合检测体系。然后利用金结合多肽竞争释放α-溶血素,在磷脂双分子层上形成纳米孔,呈现靶点核酸浓度依赖的电流信号。与传统基于纳米孔的DNA测序技术相比,HLSA不依赖超灵敏和昂贵的仪器,利用e ONEHS微型电流计即可直接进行准确测量。该方法设计了针对10种常见病原菌16S r RNA的检测探针,实现了单细胞水平的核酸检测,为病原体和病毒诊断提供了新的思路。2、胰蛋白酶原位介导气溶素原作为生物电信号探针的微生物诊断机制。为了满足超灵敏的微生物检测要求,在HLSA检测策略基础上,构建了胰蛋白酶原位介导气溶素原作为生物电信号探针的分析方法（t NASA）。t NASA突破信号放大标记物在检测探针上饱和负载量的限制,将检测的灵敏度提高近100,000倍,降低了纳米孔技术的检测限。t NASA传感器在无需复杂算法的情况下,通过一个微型的膜片钳电流放大器就能够检测a M浓度核酸和单个微生物细胞。3、肉毒素激活多肽荧光探针的微生物诊断机制。利用肉毒素中A型肉毒杆菌神经毒素轻链（Bo NT/A LC）作为诊断信号标志物,提出了一种基于BoNT/ALC激活多肽荧光探针（BACA）的微生物检测策略。Bo NT/A LC是A型肉毒素的无毒替代物,其作为高信噪比的信号探针可避免强背景信号和稳定性差等常见的问题。BACA方法基于荧光共振能量转移（FRET）分析和比色法进行测量,通过构建病原菌16S r RNAs基因的纳米杂交探针来检测靶点。利用BACA检测了六种不同细菌,结果显示该方法灵敏度能够达到单细胞水平或1 a M核酸。在面临公共卫生紧急情况时,BACA具有发展成一种简单、高效的分析工具的潜力。主要创新点:全文开发了三种基于毒素蛋白信号放大系统的病原微生物诊断技术,有效降低了假阳性率、显著提高了检测灵敏度,为病原微生物诊断提供新的研究方向。