研究背景皮肤损伤是临床上的常见病、高发病,损伤后的创面愈合问题更是给患者的生理和心理带来巨大的影响。皮肤的创面愈合一直以来都是国内外临床研究的热点与难点,它是一个复杂、有序、动态的修复过程,分为凝血期、炎症期、肉芽组织形成期以及组织重构期4个相互连贯的阶段。成纤维细胞是创面肉芽组织中主要组成细胞。在正常创面愈合的过程中,成纤维细胞能够被活化并逐渐转分化为肌成纤维细胞。肌成纤维细胞能高表达α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）,同时可合成并分泌大量的胶原蛋白、多种生长因子及酶类,在创面愈合过程中皮肤组织的重塑及纤维化形成中起关键作用。p75神经营养因子受体（p75 neurotrophinreceptor,p75NTR）是神经生长因子（nervegrowthfactor,NGF）的低亲和力受体,具有多向性功能,参与调控多种细胞的增殖、凋亡、分化、生存、迁移等多种生物学过程。p75NTR生物学功能的发挥主要取决于其配体类型、衔接蛋白及激活的信号传递通路等因素。早期对p75NTR的研究主要集中于神经系统,早期研究发现,其在神经元的发生发育、神经损伤后的修复、再生及神经保护方面具有重要作用。近年来发现,p75NTR还参与调控多种非神经系统组织的功能。研究发现,皮肤损伤时,创面组织中NGF和p75NTR的表达均明显上调,说明其在皮肤创面愈合过程中可能起重要作用。NGF是最为常见的一种神经营养因子,可由神经细胞或非神经细胞合成。在正常的生理状态下,皮肤组织中NGF可由角质形成细胞产生,并积极参与皮肤稳态的维持。在皮肤创面愈合的过程中,NGF可由感觉神经末梢、角质形成细胞及成纤维细胞以旁分泌或自分泌方式产生,并与其受体原肌球蛋白相关激酶A（tropomyosinreceptorkinaseA,TrkA）和/或 p75NTR结合,进而调控细胞的增殖、凋亡及分化等生物学过程。早期研究已证实NGF具有加速成纤维细胞迁移、促进创面再上皮化的作用,其局部应用可明显促进正常创面及糖尿病创面等各类创面的愈合。此外,NGF还可诱导皮肤成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化,但其作用的分子机制仍不明确。本课题组前期研究发现,p75NTR可以通过促进表皮干细胞的增殖、迁移及分化而加快皮肤创面的愈合。那么p75NTR是否参与调控NGF诱导的皮肤肌成纤维细胞转分化过程呢?其具体的调控机制是什么?我们通过检测p75NTR的表达模式初步推测其在皮肤组织成纤维细胞中的功能,并通过过表达及敲低p75NTR来进一步探讨其在NGF诱导的皮肤肌成纤维细胞转分化过程中的调控机制。研究目的1.通过检测p75NTR在小鼠皮肤组织成纤维细胞中的表达模式,初步探索其功能;2.通过检测p75NTR对成纤维细胞行为的影响,进一步明确其在成纤维细胞中的主要功能以及其在NGF诱导下成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化中的作用;3.通过过表达、抑制表达等分子生物学手段进一步揭示p75NTR在NGF诱导的肌成纤维细胞转分化过程中的调控机制。材料和方法1.p75NTR在小鼠皮肤成纤维细胞中的表达模式（1）小鼠皮肤成纤维细胞的原代培养:取C57BL/6乳鼠的背部皮肤,分别采用组织块法和酶消化法来原代培养小鼠皮肤组织成纤维细胞,并采用胰蛋白酶消化-再贴壁法来纯化成纤维细胞。在倒置相差显微镜下来对比观察两种方法获得的原代及传代成纤维细胞的形态特点,进行初步形态学鉴定。分别以小鼠NIH/3T3成纤维细胞、角质形成性细胞作为阳性与阴性对照,采用Western-blot检测Vimentin及Keratin的表达情况,以鉴定所获得的细胞。选用第3代细胞,采用计数法检测并绘制细胞的生长曲线以对比两种方法获得细胞的增殖情况。（2）p75NTR在小鼠皮肤组织成纤维细胞中的表达:分别培养组织块法与酶消化法原代提取的小鼠皮肤组织成纤维细胞及小鼠NIH/3T3成纤维细胞,采用免疫荧光染色、Western-blot检测p75NTR在小鼠成纤维细胞中的表达情况。2.建立p75NTR过表达/敲低稳定转染的成纤维细胞株将构建好的p75NTR过表达/敲低表达的慢病毒载体来转染小鼠NIH/3T3成纤维细胞,用2μg/ml嘌呤霉素来筛选转染后的成纤维细胞,以获得稳定转染的细胞株,并采用免疫荧光染色、Western-blot检测p75NTR在稳定转染的细胞株中的表达情况。3.p75NTR对小鼠成纤维细胞的生物学特性及肌成纤维细胞转分化的影响（1）p75NTR对小鼠成纤维细胞的生物学特性的影响:分别培养构建好的p75NTR过表达、p75NTR敲低表达及正常的小鼠成纤维细胞,检测并分析p75NTR对小鼠成纤维细胞增殖、细胞周期及迁移等生物学特性的影响。采用CCK-8法来检测p75NTR对小鼠成纤维细胞增殖的影响;采用流式细胞术来检测p75NTR对小鼠成纤维细胞周期的影响;采用Transwell技术检测p75NTR对小鼠成纤维细胞迁移的影响。（2）NGF对小鼠成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化的诱导作用:配制不同NGF浓度的（0,0.1,1,10,100 ng/ml）的培养基,分别诱导小鼠NIH/3T3成纤维细胞,采用Western-blot检测细胞中α-SMA的表达情况,对比分析最佳的诱导浓度。于最佳的诱导浓度下,采用Western-blot、qRT-PCR等实验手段在转录及翻译水平上,检测不同诱导时间（0h,24h,48h,72h）对α-SMA表达的影响。（3）NGF对小鼠成纤维细胞TrkA和p75NTR受体表达的影响:分别于0h、24h、48h及72h四个时间点下,以100 ng/ml NGF刺激小鼠成纤维细胞,采用Western-blot、qRT-PCR检测细胞中TrkA和p75NTR受体在转录及翻译水平上的表达情况。（4）p75NTR对NGF诱导的肌成纤维细胞转分化的影响:分别培养构建好的p75NTR过表达、p75NTR敲低及正常的小鼠成纤维细胞,并应用100ng/ml NGF诱导其向肌成纤维细胞转分化,采用免疫荧光染色、Western-blot、qRT-PCR检测细胞中α-SMA在转录及翻译水平的表达情况。（5）p75NTR对NGF诱导的I型胶原合成的影响:分别培养构建好的p75NTR过表达、p75NTR敲低及正常的小鼠成纤维细胞,并应用100ng/ml NGF诱导小鼠成纤维细胞,采用Western-blot、qRT-PCR检测细胞中I型胶原在转录及翻译水平的表达情况。4.p75NTR调控NGF诱导的肌成纤维细胞转分化的机制研究（1）p75NTR对NGF诱导的肌成纤维细胞转分化中F-actin、MRTF-A表达的影响:以100 ng/mlNGF诱导p75NTR过表达、p75NTR敲低及正常的小鼠成纤维细胞,采用免疫荧光染色检测F-actin、MRTF-A及α-SMA的表达变化情况,采用Western-blot技术检测MRTF-A蛋白的表达情况。（2）CCG-203971对NGF诱导的肌成纤维细胞转分化的抑制作用:采用CCK-8法测定MRTF-A抑制剂CCG-203971的IC50,绘制曲线并计算IC50值。应用100 ng/ml NGF、30μM CCG-203971刺激小鼠成纤维细胞,采用免疫荧光染色、Western-blot检测α-SMA表达情况。5.统计学分析本实验所得数据均使用GraphPad Pro.Prism 7.0软件来进行统计学分析,数据使用均数±标准差（x±s）来表示,每组实验重复3次。数据间比较:两样本之间数据的比较采用单因素方差分析t检验,多样本间的数据比较采用ANOVA检验。P<0.05代表差异具有统计学意义。结果1.p75NTR在小鼠皮肤成纤维细胞中的表达模式（1）采用两种方法原代培养的细胞经纯化后具有相同的增值能力,经Western-blot鉴定均表达成纤维细胞特征性蛋白Vimentin。相比较而言,酶消化法更为方便、快捷。（2）免疫荧光染色和Western-blot检测结果显示:p75NTR在原代获得的小鼠皮肤成纤维细胞及小鼠NIH/3T3成纤维细胞系中表达水平相似。2.建立p75NTR过表达/敲低的稳定转染细胞株免疫荧光染色和Western-blot结果显示:成功构建了 p75NTR过表达/敲低的稳定转染细胞株。3.p75NTR对小鼠成纤维细胞的生物学特性及肌成纤维细胞转分化的影响（1）CCK-8法结果显示:p75NTR对小鼠成纤维细胞的增值能力无明显影响;流式细胞术分析结果显示:p75NTR对小鼠成纤维细胞周期无明显影响;Transwell检测结果显示:p75NTR的表达水平与小鼠成纤维细胞的迁移能力呈正相关。（2）Western-blot检测结果显示:NGF诱导下α-SMA蛋白的表达与NGF的浓度呈正相关,其中100 ng/ml NGF具有显著的诱导效果。同时,qRT-PCR和Western-blot检测结果显示:α-SMA的转录和表达均在48h开始进入平台期。（3）qRT-PCR和Western-blot检测结果显示:NGF诱导下小鼠成纤维细胞p75NTR的转录和表达随时间的延长而增多,而TrkA受体的转录和表达随时间的延长无明显变化。（4）qRT-PCR、Western-blot及免疫荧光染色检测结果显示:p75NTR过表达的成纤维细胞中α-SMA的转录及蛋白表达水平显著高于对照组,而敲低组显著低于对照组。（5）qRT-CR和Western-blot检测结果显示:p75NTR过表达的成纤维细胞I型胶原的转录及蛋白表达水平显著高于对照组,而敲低组显著低于对照组。4.p75NTR调控NGF诱导的肌成纤维细胞转分化的机制研究（1）免疫荧光染色结果显示:p75NTR过表达的成纤维细胞中F-actin、MRTF-A蛋白的表达水平及MRTF-A蛋白核转位水平显著高于对照组,而敲低组显著低于对照组,且其表达变化与α-SMA相一致。Western-blot检测结果显示:p75NTR过表达的成纤维细胞中MRTF-A蛋白的表达水平显著高于对照组,而敲低组中显著低于对照组。（2）免疫荧光染色和Western-blot结果显示:NGF+CCG-203971组成纤维细胞的α-SMA的表达水平明显低于NGF组。结论1.p75NTR在原代培养小鼠皮肤成纤维细胞和小鼠NIH/3T3成纤维细胞中表达水平相似,值得进一步深入研究。2.100 ng/ml NGF在24、48h时可显著诱导小鼠成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化,且p75NTR可调控NGF诱导的肌成纤维细胞转分化及I型胶原蛋白的合成过程。3.NGF通过p75NTR-F-actin-MRTF-A信号通路诱导小鼠成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化。