巨噬细胞是机体维持内环境稳定的重要免疫细胞,也是造血系统中可塑性最强的细胞。在外界刺激下巨噬细胞呈现不同的表型和功能,主要包括经典活化的促炎M1型巨噬细胞、替代活化的抑炎M2型巨噬细胞。巨噬细胞的功能多样性与多种疾病,如肿瘤、急性炎症等密切相关。在急性炎症过程中,巨噬细胞表现为促炎表型,持续过强的炎症会引起休克及多器官衰竭。在肿瘤发生过程中,肿瘤微环境募集血液循环中的单核细胞并驯化为肿瘤相关巨噬细胞（Tumorassociatedmacrophages,TAMs）。TAMs 主要与 M2 表型功能相似,发挥促肿瘤作用。临床研究显示,通过重编程使TAMs转化为M1表型能抑制肿瘤发展。因此,阐明巨噬细胞重编程的调控机制,对于多种疾病治疗具有重要意义。信号通路激活、代谢、转录因子等多种因素参与调控巨噬细胞可塑性。据文献报道,不同极化类型巨噬细胞呈现不同的代谢状态,M1型促炎巨噬细胞以无氧糖酵解为主,伴随氧化磷酸化水平降低,而M2型抑炎巨噬细胞以氧化磷酸化为主要供能途径。糖酵解能力增强可以显著加强巨噬细胞促炎因子的合成、释放。另一方面,转录因子对巨噬细胞基因表达谱式的建立和维护起着关键的作用。阻断相关信号通路激活、抑制转录因子表达可以重塑巨噬细胞的表型功能。因此,发现调控巨噬细胞极化的关键转录因子并揭示其调控机制,对于调控巨噬细胞表型和功能、治疗疾病至关重要。ZHX2（Zinc fingersand homeoboxes2）属于锌指蛋白与同源框蛋白家族,参与肿瘤、发育等多种病理生理过程。本课题组及相关文献研究发现,ZHX2可以通过调控周期蛋白等抑制肝癌的发展。新近研究报道,ZHX2作为THP1单核细胞的重要转录因子,严格控制单核细胞的转录调控网络。动物研究发现,ZHX2通过影响巨噬细胞凋亡参与动脉粥样硬化过程,提示ZHX2参与巨噬细胞调控。然而ZHX2是否影响巨噬细胞重塑,迄今尚无报道。综上所述,本文旨在研究ZHX2在巨噬细胞重塑中的关键作用,并选择与巨噬细胞极化密切相关的重要疾病:肿瘤及脓毒血症,研究ZHX2通过影响巨噬细胞极化参与相关疾病的作用,以期为重塑巨噬细胞进行疾病干预提供新靶点。根据研究目的,本文分为以下三个部分:（1）ZHX2调控巨噬细胞重塑的作用及机制;（2）ZHX2重塑巨噬细胞在急性炎症疾病-脓毒症中的作用及机制;（3）ZHX2重塑巨噬细胞参与肝癌的作用及机制。第一部分ZHX2通过调控糖酵解重塑巨噬细胞巨噬细胞是可塑性最强的免疫细胞,在不同环境刺激下呈现为不同表型。为明确ZHX2在巨噬细胞极化中的作用,本论文首先检测不同条件刺激下巨噬细胞中ZHX2的表达变化;随后繁育髓系细胞特异性Zhx2敲除（MKO）小鼠,提取WT和MKO小鼠骨髓来源巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophages,BMDMs）,进行RNA-seq及体内外实验。一、Zhx2是影响巨噬细胞分化的重要调控转录因子之一首先我们用LPS刺激来自C57BL/6野生型小鼠的BMDMs以及对照BMDMs进行 RNA-seq 测序。通过 GSEA（Gene Set Enrichment Analysis）分析选择与细胞分化相关的通路并筛选其中转录因子,发现Zhx2是影响巨噬细胞分化的重要调控转录因子之一。二、不同极化状态巨噬细胞中ZHX2表达显著不同为明确ZHX2与巨噬细胞极化的相关性,我们分别利用经典的M1、M2刺激剂LPS、IL-4以及模拟肿瘤微环境的肝癌细胞条件培养基（HCM）刺激不同来源巨噬细胞。RT-qPCR、Western Blot（WB）检测ZHX2的表达变化。结果显示,LPS刺激后巨噬细胞系RAW264.7细胞ZHX2表达明显升高;相反,IL-4刺激后RAW264.7细胞ZHX2表达显著降低,上述作用均呈现时间、剂量梯度依赖性。分别制备小鼠肝癌细胞Hepa1-6、H22条件性培养基及人肝癌细胞系Huh7条件性培养基,同上分别刺激小鼠BMDMs和人单核细胞系THP1,RT-qPCR、WB结果证明,肝癌细胞条件性培养基刺激后不同来源巨噬细胞中的ZHX2表达以时间、剂量依赖性降低。三、Zhx2敲除显著抑制巨噬细胞的促炎表型及功能1.RNA-seq结果显示,Zhx2敲除显著抑制巨噬细胞促炎基因表达对WT和MKO小鼠BMDMs的RNA测序,并进行GSEA C3 Motif Gene Sets以及C7 Immunologic Gene Sets分析,结果显示,相对于MKO组,野生型小鼠BMDMs中M1型巨噬细胞及炎性应答相关通路均显著富集,RT-qPCR和WB进一步检测相关基因的表达。结果证实,敲除Zhx2的巨噬细胞中M2型巨噬细胞标记物Arg1、CD206显著升高,M1型巨噬细胞标记物iNOS、TNF-α、IL-6以及IL-1β的表达显著降低。2.功能研究证实ZHX2参与调控多种条件刺激的巨噬细胞极化为明确ZHX2在巨噬细胞重塑中的作用,分别用LPS和IL-4刺激WT及MKO来源巨噬细胞,通过RT-qPCR、WB、ELISA以及流式细胞术检测巨噬细胞表型及功能分子表达。（1）ZHX2明显增强LPS诱导的巨噬细胞促炎表型分离WT、MKO小鼠的BMDMs,体外进行LPS诱导,RT-qPCR、WB、ELISA以及流式等方法检测促炎相关因子的表达。结果显示,MKO小鼠的巨噬细胞中iNOS、TNF-α、IL-6等表达显著降低。随后在MKO小鼠BMDMs中过表达ZHX2,进行拯救实验,RT-qPCR以及ELISA结果显示,过表达ZHX2可以逆转LPS诱导的MKO小鼠BMDMs促炎因子减少,充分表明ZHX2增强M1型巨噬细胞促炎因子表达。（2）ZHX2明显抑制IL-4诱导的巨噬细胞抑炎表型为进一步明确ZHX2在巨噬细胞重塑中的作用,在体外对来自WT和MKO小鼠的BMDMs进行IL-4诱导,同上检测抑炎相关基因的表达变化。结果显示,敲除Zhx2后巨噬细胞中Arg1、CD206、TGF-β及IL-10表达明显升高。进一步在敲除Zhx2的BMDMs中过表达ZHX2显著逆转上述基因表达。提示,ZHX2减弱IL-4诱导的巨噬细胞抑炎表型。IL-4诱导的M2型巨噬细胞能够促进肿瘤细胞的增殖和迁移。为验证ZHX2调控巨噬细胞M2极化对肝癌细胞的作用,IL-4刺激不同来源的BMDMs后与小鼠肝癌细胞Hepa1-6共培养,Transwell实验检测Hepa1-6细胞迁移能力,CCK-8检测肝癌细胞增殖能力。结果显示,与WT来源BMDMs相比较,敲除Zhx2基因的BMDMs在IL-4诱导下显著促进Hepa1-6细胞增殖和迁移,进一步证实ZHX2抑制IL-4诱导的M2型巨噬细胞极化。四、ZHX2通过转录调控PFKFB3促进糖酵解重塑巨噬细胞表型和功能RNA-seq数据进行GSEA分析,结果显示与MKO BMDMs相比较,WT来源BMDMs中糖酵解通路显著富集,多个糖酵解相关酶表达升高;RT-qPCR、WB证实,敲除ZHX2的巨噬细胞中PFKFB3等糖酵解关键酶表达显著降低,提示ZHX2可以促进巨噬细胞糖酵解。为验证ZHX2对巨噬细胞糖酵解的调控作用,分别以LPS、IL-4刺激WT及MKO来源BMDMs,Seahorse检测细胞外酸化率（ECAR）和细胞的耗氧率（OCR）,分别代表糖酵解水平和氧化磷酸化水平。结果显示,LPS刺激下,MKO组的BMDMs糖酵解能力显著降低,乳酸盐分泌降低;IL-4刺激后其氧化磷酸化水平明显升高。进一步的抑制剂阻断实验结果证实,2-DG抑制糖酵解后,Zhx2促进LPS诱导巨噬细胞炎性表型功能明显减弱甚至消失。提示,ZHX2通过增强巨噬细胞糖酵解促进巨噬细胞促炎表型的重塑。WT及MKO来源BMDMs的RNA-seq分析显示,ZHX2调控多个糖酵解关键酶的表达,其中PFKFB3变化最明显。WB及双荧光报告实验证实ZHX2促进Pfkfb3基因转录。进一步ChIP实验发现ZHX2可以结合Pfkfb3基因启动子区域。构建PFKFB3过表达慢病毒,进行拯救实验,Seahorse检测巨噬细胞ECAR变化。结果显示,过表达PFKFB3后,MKO小鼠来源的BMDMs的糖酵解能力得到明显的逆转。综上所述,ZHX2通过转录调控PFKFB3促进巨噬细胞糖酵解,进而调控LPS刺激诱导的巨噬细胞极化。巨噬细胞极化在多种疾病中发挥重要作用。为进一步明确ZHX2调控巨噬细胞极化的病理生理学意义,本论文选择脓毒症和肝癌分别作为急性疾病及慢性疾病的代表,研究ZHX2参与巨噬细胞可塑性调控在疾病发生中的作用。第二部分巨噬细胞ZHX2促进PFKFB3转录增强糖酵解加重脓毒症脓毒症是由感染引起的全身炎症反应综合征,发病率高、凶险且致死率高。前期结果显示敲除ZHX2抑制巨噬细胞的炎性反应,本部分通过两种脓毒症小鼠模型研究ZHX2重塑巨噬细胞在脓毒症中的作用。一、MKO小鼠明显抵抗脓毒症WT和MKO小鼠通过LPS腹腔注射以及盲肠结扎穿刺诱导脓毒症,检测小鼠生存期,收集血清,ELISA检测炎性因子表达以及乳酸盐含量,并取小鼠肺组织进行HE染色。结果显示,髓系特异性敲除Zhx2显著缓解脓毒症引起的小鼠死亡、降低血清炎性因子TNF-α IL-6和IL-1β及乳酸含量,伴随肺组织炎性浸润及损伤减少。二、ZHX2促进脓毒症小鼠巨噬细胞促炎因子分泌进一步收集上述WT和MKO脓毒症小鼠脾细胞,流式检测不同的免疫细胞亚群及巨噬细胞中炎性因子表达,结果显示髓系敲除Zhx2后不影响包括T细胞、B细胞、NK细胞及DC细胞在内的多种免疫细胞的比例以及数量,而敲除Zhx2的巨噬细胞中TNF-α、IL-6以及IL-1β的比例以及荧光强度明显降低。同样,利用磁珠纯化脾脏巨噬细胞进行RT-qPCR检测,及利用贴壁腹腔居留巨噬细胞进行WB检测,均获得一致的结果。由此得出结论,脓毒症小鼠中ZHX2促进巨噬细胞分泌炎性因子。三、ZHX2通过转录调控PFKFB3表达增强巨噬细胞糖酵解水平加重脓毒症论文第一部分体外研究显示,ZHX2通过增强糖酵解促进巨噬细胞促炎表型的重塑。与此一致,分别以WT、MKO小鼠构建LPS脓毒症模型,取腹腔居留巨噬细胞检测糖酵解能力及乳酸盐分泌。结果显示MKO脓毒症小鼠中巨噬细胞糖酵解能力明显减低,且乳酸盐分泌减少。进一步以2-DG预处理WT和MKO小鼠后再注射LPS诱导脓毒症,对小鼠进行生存期分析、血清炎性因子及乳酸盐检测、小鼠肺组织病理学检测。结果发现,2-DG预处理阻断糖酵解明显消除了巨噬细胞Zhx2敲除对脓毒症的保护作用。这一结果在辐照小鼠回输实验中得到了验证。回输慢病毒介导PFKFB3过表达巨噬细胞部分抵消了 MKO小鼠对脓毒症的保护作用,伴随血清炎性因子、乳酸盐分泌水平升高。综上,ZHX2调控巨噬细胞促进脓毒症的作用依赖于其对Pfkfb3基因的转录调控和糖酵解的促进。第三部分ZHX2通过肿瘤相关巨噬细胞重塑抑制肝癌发生发展巨噬细胞是肝癌微环境中最重要的免疫细胞之一,大量肿瘤相关巨噬细胞的浸润与肝癌不良预后显著相关。该部分通过体内外实验,结合临床病例,研究ZHX2影响TAMs重塑并参与肝癌发生的作用及机制。一、肿瘤相关巨噬细胞中ZHX2表达降低1.小鼠肝癌组织TAMs中ZHX2表达显著降低第一部分结果显示以HCM模拟肿瘤微环境刺激巨噬细胞明显抑制ZHX2表达,随后我们构建了 H22皮下移植瘤以及原位肝癌模型并分离肿瘤相关巨噬细胞检测ZHX2表达情况。RT-qPCR结果显示,TAMs中的ZHX2表达明显降低。进一步收集成瘤一周和成瘤四周的H22皮下成瘤和H22肝原位瘤肿瘤相关巨噬细胞,RT-qPCR、WB方法比较ZHX2表达变化,结果显示,随着肿瘤的发展,TAMs中ZHX2表达逐渐降低。2.临床样本肝癌组织TAMs中ZHX2表达明显降低收集临床肝癌标本,分离癌和癌旁组织中的巨噬细胞,RT-qPCR检测ZHX2表达情况。与动物实验结果一致,HCC患者TAMs中的ZHX2表达显著降低。制备肝癌组织和癌旁组织的匀浆液刺激THP1细胞,RT-qPCR、WB结果证实,癌组织匀浆刺激后THP1中的ZHX2表达降低。同样,对肝癌组织芯片CD68/ZHX2的免疫荧光双染结果显示,肝癌组织TAMs中ZHX2显著低表达,且TAMs低表达ZHX2与患者生存期明显正相关。二、肿瘤微环境中乳酸盐积累抑制巨噬细胞ZHX2表达为明确介导TAMs中ZHX2表达降低的肿瘤微环境因素,我们对HCM进行如下处理:以3kD为界分离各成分或加热HCM使蛋白变性,处理后的成分进一步刺激BMDMs,RT-qPCR以及WB检测ZHX2表达变化。结果显示,肿瘤微环境中,分子量小于3kD且热稳定的成分是引起巨噬细胞中ZHX2表达降低的主要因素。肿瘤细胞中存在Warburg效应,因此肿瘤微环境中积累大量乳酸盐。且文献报道,乳酸能诱导巨噬细胞Arg1等促肿瘤分子的表达。我们用乳酸盐刺激巨噬细胞后,RT-qPCR以及WB结果发现,乳酸盐明显抑制巨噬细胞ZHX2表达降低,并呈现时间、剂量依赖性。且乳酸盐抑制剂可以消除HCM对巨噬细胞ZHX2表达的抑制作用。进一步的启动子双荧光素酶检测实验证实乳酸盐显著抑制Zhx2基因启动子活性。上述结果证明,乳酸盐是抑制巨噬细胞中ZHX2表达变化的主要肿瘤微环境因素,乳酸盐抑制Zhx2启动子活性。三、巨噬细胞中敲除Zhx2促进肝癌进展为明确TAMs低表达ZHX2对肝癌的影响,我们首先用HCM刺激WT和MKO小鼠来源的BMDMs,与肝癌细胞Hepa1-6共培养,或收集上清刺激Hepa1-6,Transwell以及CCK-8检测肝癌细胞迁移、增殖能力的变化。结果显示,敲除Zhx2的BMDMs在HCM刺激下,显著促进Hepa1-6细胞的迁移和增殖能力。为进一步在体内验证上述结果,我们构建了三种小鼠肿瘤模型:H22皮下移植瘤、STZ-HFD诱发肝癌以及小鼠胆管癌模型。首先,在皮下成瘤小鼠模型中,分别将来自WT和MKO小鼠的BMDMs与H22混匀后皮下成瘤,瘤体测量结果显示,MKO来源巨噬细胞注射组肿瘤增殖快、瘤体瘤重大。为排除荷瘤小鼠自身巨噬细胞影响,分别在WT和MKO小鼠进行皮下H22成瘤,检测到相同的结果,同时WB结果显示MKO组肝癌细胞中PCNA表达升量高,Ki67免疫荧光染色显示MKO组肝癌细胞增殖快。其次,用WT和MKO小鼠构建STZ-HFD诱发肝癌模型,生存率分析结果显示,MKO组小鼠生存率显著降低且肿瘤较大。第三,分别在WT和MKO小鼠中尾静脉注射睡美人转座子及携带lucierase报告基因的Akt-cMyc质粒,诱导胆管癌模型,小鼠活体成像检测发现,MKO小鼠的肿瘤荧光强度明显高于WT组,且小鼠肿瘤数目更多。上述体内实验均证明巨噬细胞中敲除Zhx2后显著促进肝癌的发生发展。四、ZHX2促进TAMs表型转化并改善肿瘤微环境为明确巨噬细胞中ZHX2如何影响肝癌的发展,利用流式检测WT和MKO小鼠皮下成瘤模型以及STZ-HFD诱发肝癌模型中,肝癌相关巨噬细胞不同分子表达,结果显示,MKO小鼠TAMs具有明显的促肿瘤表型,表现为MHC-II、TNF-α表达降低,而CD206、Arg1及TGF-β表达升高。进一步检测肿瘤组织T细胞以及免疫检查点分子表达变化。结果显示,MKO组肿瘤呈现更严重的免疫抑制环境,表现为Treg含量增多、CD8+T细胞表达PD-1、Tim-3明显升高。提示,巨噬细胞敲除Zhx2后增强TAMs促肿瘤的表型,同时增强肿瘤的免疫抑制微环境进而促进肝癌的发生发展。五、ZHX2通过抑制巨噬细胞分泌TGF-β减弱HCM诱导的TAMs促癌作用第一部分结果中我们发现ZHX2抑制巨噬细胞中TGF-β表达分泌。为验证TGF-β在Zhx2调控巨噬细胞抑制肝癌细胞迁移增殖中的作用,我们构建髓系特异性敲除TGF-β（TGF-β MKO）小鼠,取TGF-β MKO小鼠BMDMs细胞并感染ZHX2干扰慢病毒进行拯救实验,HCM诱导刺激后,与肝癌细胞共培养,或收集上清刺激Hepa1-6。Transwell及CCK-8检测Hepa1-6迁移以及增殖能力变化。结果显示,敲除TGF-β显著抑制了Zhx2缺失的巨噬细胞对肝癌细胞增殖、迁移的促进作用。我们进一步构建髓系细胞特异性Zhx2和TGF-β双敲除（TZMKO）小鼠,同上进行肝癌细胞共培养或刺激实验,Transwell以及CCK-8结果显示,相对于MKO组,双敲除组中,Hepa1-6的迁移和增殖能力明显减弱,加入外源TGF-β后迁移和增殖能力再次增强。上述结果显示,ZHX2抑制TAMs中TGF-β分泌,进而抑制肝癌细胞增殖及侵袭迁移。结论:ZHX2作为调控巨噬细胞的重要转录因子,可以通过促进巨噬细胞糖酵解水平重塑巨噬细胞表型,促进巨噬细胞向促炎表型转化。ZHX2对巨噬细胞糖酵解的影响依赖其对糖酵解关键酶PFKFB3的转录促进。疾病模型研究证实,ZHX2重塑巨噬细胞参与急性疾病和慢性疾病进展。在脓毒症中,ZHX2增强巨噬细胞促炎因子的分泌,加重脓毒症的炎症反应、组织损伤、乳酸积累以及死亡率。在肝癌中,ZHX2重塑肿瘤相关巨噬细胞向促炎表型转化,抑制TGF-β分泌进而抑制肝癌发生发展。综上所述,ZHX2通过对巨噬细胞重塑在肿瘤、急性感染中发挥重要作用。