窦房结、房室结、房室束及左右束支构成心脏中枢传导系统,左右束支的远侧分支及Purkinje纤维网构成心脏周围传导系统。随着发育生物学和分子遗传学的快速发展,应用细胞标记、原位杂交、转基因和基因敲除等技术对不同种属动物传导系的发育做了大量研究,但由于传导系发育的复杂性及不同动物的种属差异性,对传导系各组成部分的起源及发育机制尚存在许多争议。探讨胚胎心脏传导系的发育机理不但是重要的基础理论研究,也可为探讨由于传导系发育异常导致的先天性心脏病的发病机理提供理论依据,对此类先天性心脏病的预防和治疗有重要的意义,同时为研究成体心律失常发生机制的胚胎学起源提供一定的理论基础。窦房结是正常心律的起搏点,窦房结产生的兴奋经传导系传导至心房和心室的普通工作心肌,上作心肌的兴奋引起心房和心室的收缩,完成心脏射血过程。心脏传导系心肌和工作心肌的分化受不同的基因程序调控,表达不同的与功能相关的蛋白质。日前,对传导系心肌、工作心肌发育的研究多集中在基因转录水平和对敲、转基因小鼠的研究,而对这些基因所编码的蛋白在正常胚胎心脏传导系心肌和工作心肌发育过程中的时空表达规律研究甚少。由于人胚胎标本缺乏,对人胚心脏传导系发育研究甚少,主要限于形态学的描述或非特异性标记蛋白,如神经组织抗原G1N2和HNK-1在C14期以后较大胚龄人胚心脏传导系心肌的表达,对早期人胚心脏传导系的发育缺乏系统研究。对转基因和基因敲除的小鼠研究表明,多种转录因子和离子通道蛋白参与了小鼠心脏传导系的发育。这些转录因子和离子通道蛋白是否在人胚心脏传导系发育过程中也发挥同样的调控作用尚不清楚。本实验第一章通过观察心肌肌球蛋白重链(MHC)、超级化激活环核苷酸门控阳离子通道蛋白4(HCN4)、缝隙连接蛋白43(Cx43)和平足蛋白(PODOPLANIN)在胚龄9d-16d小鼠胚胎心脏的表达特征,探讨HCN4、Cx43和PODOPLANIN在小鼠胚胎心脏的表达规律与小鼠心脏传导系的发生。第二章通过观察缝隙连接蛋白43(Cx43)在胚龄9d-17d小鼠胚胎心脏的阳性和阴性表达特征,结合免疫印迹法检测胚龄11d、13d、15d、16d和17d小鼠胚胎心脏组织中Cx43蛋白含量,探讨Cx43在小鼠胚胎心脏的时空表达模式与心脏传导系心肌及工作心肌发育的关系。第三章通过观察MHC、HCN4、结蛋白(Desmin)、转录因子TBX3、转录因子Nkx2.5和转录因子ISL-1在C9～C16期人胚心脏的表达规律,探讨甲期人胚心脏传导系的发育机理。第一章HCN4、Cx43和PODOPLANIN在小鼠胚胎心脏的表达与心脏传导系的发生用抗心肌肌球蛋白重链(MHC)、抗超级化激活环核苷酸门控阳离子通道蛋白4(HCN4)、抗缝隙连接蛋白43(Cx43)和抗平足蛋白(PODOPLANIN)抗体对40只胚龄9d-16d小鼠胚胎心脏连续石蜡切片进行免疫组织化学或免疫荧光染色,观察HCN4、Cx43和PODOPLANIN在小鼠胚胎心脏的表达规律与小鼠心脏传导系的发生。结果显示：胚龄9d,较强的HCN4阳性染色出现在MHC表达较弱或阴性的心房和静脉窦壁。胚龄10d,静脉窦右角管壁显示较强的HCN4阳性表达。胚龄lld-16d,随窦房结的形成并发育,较强的HCN4阳性表达逐渐向窦房结转移,而心脏其它部位的HCN4阳性表达逐渐下降。胚龄11d开始,Cx43阴性表达显示部位特异性：Cx43阴性染色从心房背侧壁沿房间隔与房室管腹侧壁相连；Cx43阴性染色从窦房结沿左、右静脉瓣和心房背侧壁心肌向房室管背侧壁延伸；胚龄13d,左、右静脉瓣相继与房间隔底部融合后,Cx43阴性染色进一步沿右侧静脉瓣、冠状窦口及背侧间充质突的前方,延续为房室管背侧壁Cx43阴性的房室结,继而与室间隔顶部Cx43阴性的房室束相连。胚龄9d-10d,在MHC阳性心肌和MHC阴性的心包腔背侧壁脏壁中胚层及静脉窦周间充质细胞均显示PODOPLANIN阳性表达。胚龄11d-13d, PODOPLANIN阳性间充质细胞沿心脏外表面扩展形成PODOPLANIN阳性间皮样心外膜。胚龄14d后,PODOPLANIN在心外膜的表达消失,在MHC阳性的大部分心肌表达下降,PODOPLANIN较强阳性表达局限在心房小梁心肌、束支及相连的心室部分小梁心肌。由此我们认为：在小鼠胚胎发育早期,较强的HCN4阳性表达位于静脉窦,随发育,逐渐向窦房结转移,与电生理研究发现的主起搏点在胚胎心脏的转移路径相吻合。在小鼠胚胎发育第11天即可观察到Cx43阴性心肌构成的发育中的心脏传导系的早期雏形。PODOPLANIN促进心肌前体细胞分化为心肌细胞,参与胚胎发育早期心肌和部分工作心肌和传导系心肌的形成。PODOPLANIN可能促进心外膜细胞向心肌层的迁移和分化。第二章Cx43在小鼠胚胎心脏的时空表达模式与心脏传导系心肌、工作心肌发育的关系用抗缝隙连接蛋白43(Cx43)、抗心肌肌球蛋白重链(MHC)和抗横纹肌肌节肌动蛋白(α-SCA)对45只胚龄9d-17d小鼠胚胎心脏连续切片进行免疫组织化学或免疫荧光染色,用免疫印迹(Western blotting)方法检测胚龄l1d、13d、15d、16d和17d小鼠胚胎心脏组织中Cx43蛋白含量,观察缝隙连接蛋白Cx43在小鼠胚胎心脏的时空表达模式与心脏传导系心肌、工作心肌发育的关系。结果显示：胚龄9d-lOd,Cx43弱阳性表达首先出现在左心室腹侧壁及原始小梁心肌。胚龄11d以后,Cx43在心房、心室的阳性表达范围逐渐扩大,阳性表达强度逐渐增强。胚龄lld-16d,Cx43阳性染色依次出现在心房的顶部、前壁、外侧壁和小梁心肌等部位,在心室,Cx43阳性染色从心尖部逐渐扩展至左、右心室的小梁心肌和致密心肌,而在窦房结中央、左右静脉瓣、房间隔、右心房背侧壁、房室管及发育中的房室结和房室束均未见Cx43阳性染色,构成发育中的心脏传导系雏形。胚龄17d,Cx43在左右静脉瓣、房间隔及右心房背侧壁的阴性染色转为Cx43弱阳性染色,仅在窦房结、房室结、房室束等部位保持Cx43阴性染色。较强的Cx43阳性染色沿室间隔两侧左、右束支延续至左、右心室小梁心肌。至此,Cx43阴性心肌构成胚胎心脏中枢传导系,而Cx43阳性心肌构成胚胎心脏周围传导系心肌和工作心肌。免疫印迹结果显示,胚龄11d-17d,Cx43蛋白在胚胎心脏的含量随发育逐渐增多。由此我们认为：Cx43在心房和心室阳性表达不断扩展,表明心房和心室原始心肌细胞向工作心肌细胞分化。Cx43阴性心肌和Cx43阳性的周围传导系心肌共同构成胚胎心脏完整的传导系。在心脏发育晚期,心房传导系心肌范围逐渐缩小,而工作心肌范围逐渐扩大。Cx43在胚胎心脏的时空表达模式与心脏传导系心肌、工作心肌的正常发育和兴奋传导功能相适应。第三章人胚心脏传导系的早期发育用抗心肌肌球蛋白重链(MHC)、抗超级化激活环核苷酸门控阳离子通道蛋白4(HCN4)、抗结蛋白(Desmin,DES)、抗转录因子TBX3、抗转录因子Nkx2.5和抗转录因子ISL-1抗体对27例C9-C16期(Carnegie stage9～Carnegie stage16,排卵后20+1-37天)人胚心脏连续石蜡切片进行免疫组织化学染色,探讨早期人胚心脏传导系的发育机制。结果显示：人胚C9-C10期,TBX3在原始心管表达广泛。Cll期开始,TBX3在心管不同部位的表达强度出现差异。C11-C16期,TBX3较强阳性表达逐渐局限在发育中的窦房结、左右静脉瓣、房室管、房室结、室间隔顶部发育中的房室束及束支等部位。连续切片观察：较强的TBX3阳性染色经房室管壁向心房侧经右侧静脉瓣延伸至发育中的窦房结；向心室侧,经房室管右侧壁延续至室间隔顶部发育中的房室束和左右束支。较强的DES阳性染色首先出现在C10期人胚心脏房室管右侧壁,随发育,DES阳性染色扩展至发育中的窦房结、左右静脉瓣、房室管、房室结、房室束及束支等部位,和TBX3显相同的表达模式。DES较强阳性染色还出现在心房背侧壁、冠状窦和心室腔而小梁心肌。人胚C10-C13期,心管尾端的静脉窦左、右角发育不平衡,静脉窦右角Nkx2.5和MHC阴性表达,但显示第二生心区标记蛋白ISL-1阳性染色,而静脉窦左角表达较强的Nkx2.5和MHC,已失去ISL-1阳性表达。人胚C14期,近右心房的右上腔静脉右侧壁增厚,形成形态可辨的ISL-1、DES阳性、Nkx2.5阴性的窦房结原基,TBX3在窦房结的表达从邻近右侧静脉瓣局部不断向远端扩展。人胚C9期,HCN4在原始心管心肌均显示弱阳性表达。人胚C10-C13期,HCN4阳性染色从流出道、心室、房室管和心房延仲至静脉窦左、右角,且从心管动脉端到静脉端的阳性染色逐渐增强,在Nkx2.5阳性的静脉窦左角壁的表达明显强于Nkx2.5阴性的静脉窦右角壁。人胚C14-C16期,随着窦房结和静脉瓣等结构在静脉端右侧形成,HCN4在心房、心室心肌阳性表达逐渐减弱,HCN4较强阳性逐渐局限于窦房结和静脉瓣等部位。由此我们认为：TBX3阳性表达确定早期人胚心脏中枢传导系。DES标记人胚早期传导系,包括发育中的中枢传导系和周围传导系。HCN4在人胚心脏的时空表达规律为电生理研究发现的主起搏点的转移路径提供了形态学证据。Nkx2.5表达阴性是保证窦房结在静脉端右侧正常发育的必要的基因调控机制。成体心律失常的发生部位具有特定的胚胎学起源。