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本实验室前期利用酵母双杂交技术,筛选获得了与心脏发育基因Foxp4相互作用的15个候选蛋白,并分析了其中3个候选蛋白与Foxp4相互作用的情况。本文进一步分析其它12个候选蛋白是否与Foxp4相互作用,为研究Foxp4调控心脏发育的信号通路提供信息。本研究首先克隆12个与Foxp4相互作用的候选基因：Acta1、C17orf81、ABHD11、PTP4A3、RMBD5B、TNXB、HLA-DPB1、Loc100288161、COL1A1、COL3A1、COL4A2和FN1。从成人的肌肉和心脏组织中提取总RNA,反转录合成cDNA作为PCR扩增的模板。通过巢式PCR将扩增的目的片段克隆入pMD18T载体,经酶切检测与测序鉴定后,转入真核表达载体pCMV-Myc上。结果表明成功克隆了12个基因并构建出这12个基因的真核表达质粒。我们进一步将12个基因的pCMV-Myc质粒分别与pCMV-Tag2c-Foxp4质粒转染Hek293细胞后,进行免疫共沉淀实验。经抗Flag和Myc单抗两个方向检测Foxp4蛋白与12个蛋白之间的相互作用,证明12个候选对象中有3个候选蛋白Acta1、COL1A1和COL4A2与Foxp4有相互作用。我们同时制备了斑马鱼Foxp4基因多克隆抗体,检测了Foxp4基因在斑马鱼早期胚胎和成体组织中的表达情况,发现Foxp4从1细胞期开始,随着胚胎发育的延续,其表达量逐渐增多,囊胚期开始下调,90%外包期又开始回升。Foxp4在成体组织中广泛表达,在脑、肌肉和鳃中表达较强,在心脏和眼中表达较弱。我们还进一步研究了其中一个候选基因Fbxl5在胚胎发育过程中的时空表达,并利用基因芯片分析敲低Fbxl5的表达时对其它基因表达的影响。通过搭桥PCR的方法克隆了斑马鱼Fbxl5基因,制备了该基因多克隆抗体。利用该抗体分析了斑马鱼早期胚胎和成体组织中的表达情况,发现Fbxl5在胚胎发育中一直较稳定表达,1细胞期表达较多,随着胚胎发育表达量略有下降,囊胚期开始又回升之后除24 h表达量较低外,其余时期均较稳定表达。斑马鱼成体中,Fbxl5在脑、心脏、肾、鳃、肌肉、肠中表达,其中鳃中表达最强,而在肌肉,肠中表达较弱。利用Fbxl5-MO敲低Fbxl5在斑马鱼胚胎中的表达,分析发育48 h和对照胚胎样品的mRNA含量差异,基因芯片分析结果表明,斑马鱼14295个基因中共检测到差异性表达的基因1874个,包括心脏标志基因tnc、vmhc、myl7等。总之,本文克隆出12个与Foxp4相互作用的候选基因,通过免疫共沉淀技术进一步证明其中3个基因Acta1、COL1A1和COL4A2与Foxp4相互作用,制备了斑马鱼Foxp4基因多克隆抗体,分析了其在斑马鱼早期胚胎中和成体组织中的表达情况,为进一步探清Foxp4的分子机制奠定了基础。同时,对候选基因Fbxl5开展的一些工作为以后的研究提供了帮助。