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本文主要从以下几个方面进行论述： 第一部分 4种不同组织来源人间充质干细胞的分离培养和鉴定 间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，它已成为组织工程和再生医学细胞治疗的主要候选干细胞。成体骨髓是间充质干细胞的主要来源，也是目前研究得最为深入的MSCs来源。但是，侵袭性操作取材、细胞数量、增殖和分化能力随供者年龄增长而显著下降等因素大大限制了骨髓来源间充质干细胞的应用。大量研究已证实，间充质干细胞还存在于多种胎儿组织中，研究者已从胎儿肝脏、胎血、胎儿骨髓、胎肺、脐血、胎盘和脐带等组织中成功分离出MSCs。因此，研究骨髓以外其它来源MSCs的生物学特性对于未来的细胞治疗具有重要意义。 目的:分离鉴定成人骨髓、胎儿骨髓、胎儿胰腺和脐带来源的人间充质干细胞，比较4种MSCs生物学特性的差异，为间充质干细胞应用选择细胞来源提供实验基础和理论依据。 方法:本实验中，我们分别使用密度梯度离心、胶原酶/胰蛋白酶消化的方法分离成人骨髓、胎儿骨髓、胎儿胰腺和脐带间充质干细胞，并通过贴壁培养的方法进一步纯化4种间充质干细胞。我们对4种间充质干细胞进行细胞骨架蛋白免疫荧光染色，观察MSCs的形态特征。收集P7代4种MSCs，用CCK-8试剂盒检测间充质干细胞的增殖能力。我们用流式细胞学方法检测P3-P5代4种间充质干细胞细胞周期的分布，以及细胞表面标记和转录因子Oct3/4、Sox-2、Nanog、c-Myc的表达。体外诱导间充质干细胞向脂肪和成骨细胞分化，通过油红O、碱性磷酸酶、茜素红和vonKossa染色鉴定分化结果。体外诱导间充质干细胞向神经细胞分化，用免疫荧光染色方法检测诱导后的细胞是否表达神经细胞标志GFAP和MAP2。 结果:4种间充质干细胞体外培养时呈纺锤形、贴壁生长，成人骨髓来源的间充质干细胞(ABM-MSCs)比3种胎儿组织来源的间充质干细胞(FBM-MSCs、FPan-MSCs和UC-MSCs)体积大，呈长梭形。β-微管蛋白免疫荧光染色后，可观察到间充质细胞内的骨架蛋白结构。CCK-8检测发现胎儿组织来源的MSCs均比成人骨髓MSCs增殖速度快，不同解剖部位间充质干细胞的增殖能力存在差异，4种MSCs增殖能力由强至弱依次为UC-MSCs、FBM-MSCs、FPan-MSCs、ABM-MSCs。经细胞周期检测分析，4种间充质干细胞均有90％以上的细胞处于G0/G1期，只有少数细胞处于活跃增殖状态（G2/M期和S期）。4种间充质干细胞均表达CD90，CD105(SH2), CD73(SH3/4), CD44, CD54, CD166, CD49e, CD29和HLA-ABC(HLA-Ⅰ);不表达CD34，CD45和HLA-DR(HLA-Ⅱ);此外，4种间充质干细胞均表达转录因子Oct3/4，Sox-2，Nanog和c-Myc。油红O染色证实4种间充质干细胞能分化为脂肪细胞;碱性磷酸酶、茜素红和von Kossa染色证实诱导后的细胞具有成骨细胞活性以及钙盐沉积。免疫荧光染色证明4种间充质干细胞神经诱导后均表达神经细胞标志GFAP和MAP2。 结论:我们成功从成人骨髓、胎儿骨髓、胎儿胰腺和脐带组织中分离并鉴定出间充质干细胞，4种来源间充质干细胞的生物学特征存在一定差异。 第二部分 不同组织来源人间充质干细胞体外支持造血能力比较研究 支持造血是间充质干细胞的另一重要生理功能。骨髓间充质干细胞是造血微环境的主要前体细胞。骨髓基质细胞通过细胞接触作用和分泌可溶性因子（包括生长因子、趋化因子、细胞外基质分子等）调节造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)的存活、自我更新、迁移和分化。基质细胞对造血的促进作用并不局限于某一特定的血细胞系，对髓系、淋巴系和巨核细胞都起作用。近年来，一些研究表明其它组织（如胎盘/脐带血、脐带）来源的间充质干细胞也具有造血支持能力。但是，关于骨髓以外其它组织来源的MSCs支持巨核造血的研究尚未见报道。因此，比较分析不同组织来源间充质干细胞体外造血支持能力将为MSC应用于造血干细胞移植以及造血机制的阐明提供一定的实验依据。 目的:比较成人骨髓、胎儿骨髓、胎儿胰腺和脐带来源的间充质干细胞体外支持长期造血以及CD34+造血祖细胞扩增巨核细胞的能力。 方法:免疫磁珠分选脐带血CD34+细胞，建立4种来源的人间充质干细胞(ABM-MSCs、FBM-MSCs、FPan-MSCs、UC-MSCs)与脐带血CD34+细胞的长期共培养体系。通过LTC-IC(long-term culture-initiating cells)实验，检测4种间充质干细胞体外支持长期造血的能力。流式细胞学方法检测共培养第3、5、7周各组悬浮细胞的表型。建立4种间充质干细胞与脐带血CD34+细胞的无血清(含25 ng/mLTPO)共培养体系。共培养第7天，取出悬浮细胞进行计数、巨核细胞克隆形成实验(CFU-MK assay)以及流式细胞表型检测。培养第10-12天，收集细胞分别进行瑞式染色、免疫荧光染色和电镜观察。培养第12天，将悬浮细胞全部取出，做流式细胞表型、倍体分析以及血小板生成检测。半定量RT-PCR方法分析4种间充质干细胞造血生长因子SCF、IL-6和GM-CSF的表达。 结果:LTC-IC实验第5周FBM-MSCs组、FPan-MSCs组以及UC-MSCs组CFC(colony forming cell)的产生频率与ABM-MSCs组均无统计学差异(P＞0.05);第6、7、9周，UC-MSCs组CFC的产生频率均低于ABM-MSCs组(P＜0.05);第9周，FPan-MSCs组CFC的产生频率低于ABM-MSCs组(P＜0.05)。第3、5、7周流式细胞表型检测结果显示，随着共培养时间的延长，各组细胞CD34和CD117的阳性率均明显下降，而CD33，CD13，CD11b的阳性率逐渐上升。4种间充质干细胞与脐带血CD34+细胞在含25 ng/mL TPO的无血清体系共培养第7天，成人骨髓间充质干细胞组(CD34++ABM)和胎儿骨髓间充质干细胞组(CD34++FBM)脐带血CD34+细胞的扩增效率均明显高于对照组(CD34+ alone);而胎儿胰腺间充质干细胞组(CD34++FPan)和脐带间充质干细胞组(CD34++UC) CD34+细胞的扩增效率与对照组相当。流式细胞表型检测结果示，ABM-MSCs组和FBM-MSCs组CD34+细胞的数量均明显高于对照组(P＜0.05); ABM-MSCs组CD34+/CD41a+细胞的数量也高于对照组(P＜0.05)，而且ABM-MSCs组CD34+/CD41a+巨核祖细胞的数量最多，达413.3±185.2(×103)。CFU-MK结果显示ABM-MSCs组产生巨核细胞克隆总数明显高于其它4组(P＜0.05)。培养10-12天，瑞氏染色、免疫荧光染色和电镜观察结果表明各组细胞均具有巨核细胞的典型形态特征。培养12天后流式细胞学检测结果示，各组均有三分之一以上的细胞同时表达CD41a、CD61，以及CD41a、CD42b;各组由脐带血CD34+细胞扩增产生的多倍体(＞4n) CD41a+细胞的最高百分比接近30％（CD34++FPan组）;各组均有部分CD41a+细胞同时表达CD62P，或能结合annexinⅤ。RT-PCR结果示4种间充质干细胞均表达造血生长因子SCF、IL-6和GM-CSF。 结论:3种胎儿组织来源的间充质干细胞（FBM-MSCs、FPan-MSCs和UC-MSCs）能够在体外支持长期造血，但不同组织来源MSCs的造血支持能力存在差异，4种间充质干细胞造血支持能力由强至弱依次为ABM-MSCs、FBM-MSCs、FPan-MSCs、UC-MSCs。4种组织来源的间充质干细胞中，ABM-MSCs体外扩增CD34+细胞来源巨核祖细胞的能力最强。ABM-MSCs、FBM-MSCs、FPan-MSCs和UC-MSCs均能促进脐带血CD34+细胞来源的巨核祖细胞进一步分化为成熟的功能性巨核细胞。间充质干细胞可能通过直接细胞接触和分泌造血生长因子(GM-CSF，IL-6和SCF)的机制支持CD34+造血祖细胞向巨核细胞分化和形成血小板。