目的钙化性主动脉瓣疾病（calcific aortic valve disease， CAVD）是目前最常见的心脏瓣膜疾病类型之一。该病具体发病机制目前仍不明确。已有研究表明，钙化瓣膜中存在大量成骨细胞标志物的表达，瓣膜间质细胞向成骨细胞转分化是瓣膜钙化病理过程的关键步骤之一。本研究旨在：（一）检测人钙化性主动脉瓣膜中TWIST1及成骨细胞标志物的表达情况。（二）体外分离、培养原代人主动脉瓣瓣膜间质细胞，并建立瓣膜间质细胞-成骨细胞转分化模型，为进一步研究瓣膜间质细胞向成骨细胞转分化的分子机制奠定基础。（三）构建TWIST1过表达质粒，合成TWIST1特异性干扰RNA，在已建立的瓣膜间质细胞-成骨细胞转分化模型中分别上调或下调TWIST1的表达，研究TWIST1在瓣膜间质细胞向成骨细胞转分化过程中的生物学作用。（四）构建双荧光素酶报告基因系统，研究TWIST1对RUNX2基因P2启动子的调控作用，明确TWIST1在瓣膜间质细胞向成骨细胞转分化过程中的作用机制。方法（一）钙化瓣膜中TWIST1及RUNX2等成骨细胞标志物的表达收集我院胸心外科手术切除的退行性钙化性主动脉瓣28例作为实验组，接受心脏移植术患者或尸检患者的无钙化主动脉瓣12例作为对照组。通过总RNA抽提、荧光定量PCR技术检测TWIST1、RUNX2、OCN mRNA在人钙化主动脉瓣膜中的表达变化。通过组织总蛋白抽提、western blot技术检测TWIST1蛋白在人钙化主动脉瓣膜中的表达变化。通过组织切片、免疫组织化学技术检测TWIST1、RUNX2、PCNA在人钙化主动脉瓣膜中的表达及细胞定位。（二）人主动脉瓣瓣膜间质细胞体外培养及其成骨转分化模型的建立将人主动脉瓣外观正常部分以人II型胶原酶溶液37℃下消化30min，去除瓣膜内皮细胞。再将瓣膜以新的人II型胶原酶溶液37℃消化2h。收集分离的瓣膜间质细胞，于37℃、5%CO2环境下以含10%FBS的DMEM培养基培养。细胞融合度达到80%-90%时传代。通过vimentin细胞免疫荧光染色，流式细胞技术检测CD31细胞阳性率等方法，对体外分离、培养的瓣膜间质细胞进行鉴定。以含有100nmol/L地塞米松、50μg/ml抗坏血酸、5mmol/L β-甘油磷酸、50ng/ml重组人BMP-2的成骨诱导培养基培养瓣膜间质细胞，诱导其向成骨细胞转分化，建立瓣膜间质细胞-成骨细胞转分化模型。并通过荧光定量PCR、western blot、碱性磷酸酶活性检测等方法将检测RUNX2等成骨细胞标志物的表达，鉴定细胞模型的建立情况。（三）TWIST1在人主动脉瓣瓣膜间质细胞向成骨细胞转分化中的作用经PCR扩增TWIST1基因蛋白编码序列，酶切后连接到载体质粒pCMV中，构建TWIST1过表达质粒pTWIST1，并行碱基序列检测，对所构建的质粒进行鉴定。通过FAM标记的RNA对原代人主动脉瓣瓣膜间质细胞Lipofectamine2000的转染效率进行鉴定。pTWIST1转染瓣膜间质细胞，PCR、western blot检测TWIST1表达情况。设计并合成TWIST1特异性干扰RNA序列。筛选干扰效率高的RNA序列。利用Lipofectamine2000，在瓣膜间质细胞-成骨细胞转分化模型中分别转染TWIST1过表达质粒或TWIST1特异性干扰RNA。通过荧光定量PCR、western blot、碱性磷酸酶活性检测等方法将检测RUNX2等成骨细胞标志物的表达，研究TWIST1对人主动脉瓣瓣膜间质细胞向成骨细胞转分化的作用。并通过流式细胞技术检测TWIST1过表达对人主动脉瓣瓣膜间质细胞凋亡的影响。（四）TWIST1过表达抑制人主动脉瓣瓣膜间质细胞向成骨细胞转分化的分子机制在Genebank中查找人RUNX2基因P2启动子区E-box序列并设计两端引物。通过染色质免疫共沉淀技术，检测TWIST1可能结合的E-box序列。将含有上述E-box序列的RUNX2基因P2启动子区克隆至荧光素酶报告基因载体质粒pGL3-Basic中，测序鉴定重组质粒序列是否正确，构建是否成功。将TWIST1过表达质粒与荧光素酶报告基因质粒共同转染人主动脉瓣瓣膜间质细胞，通过双荧光素酶报告基因系统，检测TWIST1对RUNX2基因P2启动子区的调控作用。通过定点突变技术，构建含定点突变的E-box序列的荧光素酶报告基因质粒，观察特定E-box突变后TWIST1对RUNX2基因P2启动子区调控作用的改变，以确定TWIST1的作用靶点。结果（一）钙化瓣膜中TWIST1及成骨细胞标志物的表达与对照组无钙化瓣膜组织相比，实验组退行性钙化性主动脉瓣瓣膜组织中，RUNX2、OCN、PCNA等表达水平明显升高，TWIST1mRNA及蛋白表达水平均明显下降。免疫组化提示TWIST1表达定位于瓣膜间质细胞饱核。（二）人主动脉瓣瓣膜间质细胞体外培养及其成骨转分化模型的建立原代瓣膜间质细胞分离后悬浮状态下呈现圆形。细胞贴壁生长，形态呈现为梭形或纺锤形、多角形。培养后细胞密度增高，可见细胞呈簇状生长，部分细胞形态呈现为铺路石样。细胞免疫荧光vimentin染色结果显示，细胞阳性率接近100%，提示间质细胞纯度高。流式细胞技术检测细胞CD31阳性率结果显示，细胞CD31阳性率小于2%，提示内皮细胞污染少。原代人主动脉瓣瓣膜间质细胞经OIM培养2d、4d后，收集细胞检测成骨细胞标志物的表达变化。荧光定量PCR结果显示，RUNX2mRNA表达水平分别上升了1.80倍、2.55倍，OCN mRNA表达水平分别上升了1.41倍、2.24倍，ALP mRNA表达水平分别上升了3.03倍、8.66倍。Western blot结果显示，RUNX2、OPN、OCN蛋白表达水平均升高。ALP活性检测结果显示， ALP活性分别上升了2.53倍、5.91倍，差异有统计学意义。（三）TWIST1在人主动脉瓣瓣膜间质细胞向成骨细胞转分化中的作用原代人主动脉瓣瓣膜间质细胞Lipofectamine2000的转染效率可高达90%以上。经碱基序列测定，TWIST1过表达质粒pTWIST1中插入序列正确，无错误或缺失碱基，质粒构建成功。荧光定量PCR结果显示，转染pTWIST组细胞中TWIST1mRNA表达水平升高了460倍。Western blot结果也证实，转染pTWIST1组瓣膜间质细胞中TWIST1蛋白表达水平亦明显高于对照组细胞。人主动脉瓣瓣膜间质细胞-成骨细胞转分化模型中转染pTWIST1后，RUNX2、OCN、COL1、ALP mRNA表达水平，分别下降为对照组的0.72、0.74、0.64、0.59倍。Western blot结果显示， pTWIST1转染细胞中RUNX2及OPN、OCN等蛋白表达水平均下降。ALP活性测定结果显示，pTWIST1转染细胞中ALP活性，为对照组细胞的60%左右。干扰RNA筛选提示TWIST1干扰效率可接近70%。转染TWIST1干扰RNA组细胞中RUNX2及OCN、COL1、ALP mRNA表达水平分别为对照组的1.49、1.53、1.93、1.49倍。转染pTWIST1组细胞凋亡率与对照组间的差异无统计学意义。（四）TWIST1过表达抑制人主动脉瓣瓣膜间质细胞向成骨细胞转分化的分子机制经过查找，我们在人RUNX2基因P2启动子区共找到10个E-box序列。按照其第一个碱基相对于TSS（+1）的位置，分别记为E-box-2651、E-box-2426、E-box-2333、E-box-2056、E-box-1604、E-box-1556、E-box-1333、E-box-820、E-box-100、E-box+6。通过染色质免疫共沉淀检测，我们发现了两个TWIST1可能直接结合的E-box，E-box-1333和E-box-820。我们将含有E-box-1333和E-box-820的大小约1.5kbp的DNA片段克隆到载体质粒pGL3-Basic中，构建了含人RUNX2基因P2启动子区序列的荧光素酶报告基因质粒pGL3-RUNX2-P2。质粒碱基序列测定结果显示，插入序列正确，无错误或缺失碱基。转染pGL3-RUNX2-P2的瓣膜间质细胞中荧光强度明显高于转染空载体质粒pGL3-Basic的细胞，而转染pTWIST1可降低细胞中pGL3-RUNX2-P2的荧光强度。转染pGL3-P2-1333M及pTWIST1的细胞中荧光强度明显下降，说明TWIST1对pGL3-P2-1333M仍有抑制作用。而转染pGL3-P2-820M及pTWIST1的细胞中荧光强度下降不明显，说明TWIST1对pGL3-P2-820M无明显抑制作用。结论（一）钙化瓣膜中TWIST1及成骨细胞标志物的表达TWIST1在钙化瓣膜中表达下降，其可能通过影响主动脉瓣瓣膜间质细胞的功能，在瓣膜钙化过程发挥一定的生物学作用。（二）人主动脉瓣瓣膜间质细胞体外培养及其成骨转分化模型的建立体外分离、培养的原代人主动脉瓣瓣膜间质细胞纯度高、污染少，可用于后续细胞学实验。成功构建了体外瓣膜间质细胞-成骨细胞转分化模型，为研究瓣膜间质细胞表型转分化在瓣膜钙化中的作用，奠定了良好的基础。（三）TWIST1在人主动脉瓣瓣膜间质细胞向成骨细胞转分化中的作用成功构建了TWIST1过表达质粒，可成功在人主动脉瓣瓣膜间质细胞中表达TWIST1蛋白。成功合成了TWIST1特异性干扰RNA序列。TWIST1过表达可抑制瓣膜间质细胞向成骨细胞转分化，TWIST1干扰可促进瓣膜间质细胞向成骨细胞转分化。（四）TWIST1过表达抑制人主动脉瓣瓣膜间质细胞向成骨细胞转分化的分子机制TWIST1可通过直接结合于人RUNX2基因P2启动子区的E-box-820，抑制其启动子活性，从而抑制RUNX2的表达，进一步抑制瓣膜间质细胞向成骨细胞的转分化。