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壳聚糖是甲壳素脱乙酰化后的产物,在食品、医药、环保领域有着广泛的应用。但普通壳聚糖分子量大、粘度高、水溶性差,使得其应用受到限制,而低分子量壳聚糖在其应用方面具有优越的性质。传统工业上,通过酸解或氧化法制备低分子量,但其工艺复杂,成本高,易形成副产物,且污染环境。壳聚糖酶酶法处理方式能够选择性地、特异性地切断壳聚糖的糖为β-1,4-糖苷键,降解过程和降解产物的分子量易于控制,而且具有条件温和、产率高、污染小等优点,成为近年来的研究热点。本课题以自主分离到的一株产壳聚糖酶的菌株Mitsuaria sp.141-2为研究对象,研究了其生理特性;优化其产壳聚糖酶条件;分离纯化了壳聚糖酶并测定其相对分子质量;成功制备了低分子量壳聚糖,抗菌实验验证了其抗菌活性。具体研究结果如下:1、研究了菌株Mitsuaria sp.141-2的生理特性,结果表明,该菌最适培养条件为温度28℃,pH=6.8;其可以利用碳源的有:葡萄糖,氨基葡萄糖,麦芽糖,甘油,柠檬酸;该菌可以利用氨态氮,不能利用硝态氮,也不能利用尿素。同时该菌不产生纤维素酶和淀粉酶。2、优化了菌株Mitsuaria sp.141-2产壳聚糖酶的发酵条件。最适培养基组分为:壳聚糖(0.5%),胰蛋白胨(0.057%),七水硫酸镁(0.05%),磷酸二氢钾(0.03%),磷酸氢二钾(0.07%)。此条件下,Mitsuaria sp.141-2发酵液中的壳聚糖酶活可达到3.53U/mL。发酵进行到12 h时,将发酵液pH调至5.7,可使发酵液酶活从3.53U/mL提高至4.3U/mL。3、用DEAE-Sepharose CL-6B离子交换色谱对菌株Mitsuaria sp141-2所产胞外壳聚糖酶进行了分离纯化,SDS-PAGE测定其相对分子质量,结果显示,该酶的相对分子质量为31.00 ku。4、采用单因素实验对壳聚糖酶酶法制备低分子量壳聚糖的条件进行了研究,结果显示菌株Mitsuaria sp.141-2所产壳聚糖酶的最适作用条件为pH 5.0,温度65℃,加酶量6.0 U/g壳聚糖,最适底物浓度为4%。通过酶解液还原糖浓度和粘度测定以及寡糖组分分析可以得出,该壳聚糖酶只具有内切活性。用凝胶渗透色谱法和粘度法测定了制备的低分子量壳聚糖样品相对分子质量,结果显示采用上述优化条件,酶解30 min后,壳聚糖的相对分子质量从298.33 ku迅速降至26.14 ku,1 h后降至10.59 ku,2 h后则降至7.474 ku,3 h后降至3.822 ku。5、壳聚糖相对分子质量的降低使得其晶体结构发生转变且水溶性增强,考查了不同相对分子质量壳聚糖对大肠杆菌和酵母生长的影响,结果表明,Chitosan-0,Chitosan-0.5,Chitosan-1对大肠杆菌k99与酵母菌621生长有明显抑制作用,而Chitosan-2和Chitosan-3却对大肠杆菌k99与酵母菌621生长无明显抑制作用。