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猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)是引起仔猪腹泻的两大主要病毒,临床症状流行特点十分相似,但没有共同的抗原性。根据GenBank上已发表的PEDV和TGEV基因序列,针对其PEDV M基因(膜蛋白基因)保守区及TGEV的S基因(纤突蛋白基因)5’端保守区,各设计一对引物,可特异扩增出长为467bp和1062bp的目的条带,建立了一种多重RT-PCR方法同时检测猪的这两种肠道冠状病毒:PEDV和TGEV。用上述方法可对同一样品中的PEDV和TGEV可进行鉴别检测,对猪的其它病毒和细菌的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定表明,该双重PCR方法能检出PEDV1pg、TGEV0.1pg的模板。同时采用建立的多重RT-PCR与韩国引进的PEDV和TGEV病毒抗原快速诊断试剂盒检测结果显示:此多重RT-PCR法特异性强,且较快速试剂盒更加敏感。应用建立的多重RT-PCR方法对158份临床猪粪样的检测结果表明:我国很多猪场普遍存在TGEV和PEDV,尤其以PEDV污染更为严重,感染率达53.2%,但双重感染率较低,仅为4.4%。 根据GenBank中已发表的PEDV、TGEV主要结构蛋白基因cDNA序列设计合成12对引物,对国内新分离毒株PEDV JS-2004-2、PEDV AH-2004和TGEV HN2002、TGEV JS-2004进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR),分别扩增出两种病毒的S1、S2、S3、S4、M和N六个基因片段,PEDV六个片段的长度依次是1319bp、1322bp、1463bp、1193bp、917bp和1436bp;TGEV六个片段的长度依次为1117bp、1039bp、1459bp、1311bp、875bp和1296bp。将它们分别进行T/A克隆、测序并拼接成完整的基因序列。比较其与其它相应毒株核苷酸及编码氨基酸的同源性,发现TGEV HN2002和JS-2004株与国内的TS株亲缘关系相对最近,与英国的96～1933株亲缘关系相对较远;PEDVJS-2004-2株,AH-2004株和CV777株的同源性很高,S、M、N序列同源性皆在95%以上,其中JS-2004-2株和AH-2004株亲缘关系相对较近。 猪传染性胃肠炎病毒纤突蛋白(S蛋白)是诱导中和抗体产生的主要蛋白。通过RT-PCR扩增其S蛋白抗原性较好的部分基因片段的cDNA,将其按正确的阅读框架定向克隆到表达载体pET-32a中;用此重组质粒pET-32a/TGEV-S转化大肠杆菌Rosetta菌株,在浓度为1mMIPTG和28℃条件下诱导表达;经SDS-PAGE及免疫转印鉴定结果显示:重组蛋白具有免疫原性。