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目的:构建激动性抗小鼠CD40单链抗体的原核表达载体,诱导蛋白表达并纯化以获得高纯度的激动性抗小鼠CD40 sc Fv。建立小鼠肿瘤模型并体内外验证激动性抗小鼠CD40scFv增强自然杀伤(NK)细胞杀伤肿瘤的作用。方法:本实验利用基因工程技术构建激动性抗小鼠CD40 sc Fv原核表达载体,诱导蛋白表达后利用亲和层析技术获得高纯度的激动性抗小鼠CD40 sc Fv蛋白。在体外实验中使用小鼠骨髓干细胞诱导产生树突状细胞(DC),给予激动性抗小鼠CD40 sc Fv激活DC细胞,流式细胞术检测DC细胞表面CD80、CD86、MHC-II表达水平,ELISA检测培养上清中IL-12表达水平,以反应CD40sc Fv对DC的激活能力。利用CD40 sc Fv激活后的DC及培养上清刺激通过免疫磁珠分选出的小鼠NK细胞,ELISA检测NK细胞培养上清中IFN-γ水平。将激活后的NK细胞与T6-17细胞共培养,用WST-8法检测激活后NK细胞对T6-17杀伤性的变化。在体内实验中,构建Balb/c nude鼠的T6-17肿瘤模型,给予激动性抗小鼠CD40 sc Fv瘤体注射,记录并对比肿瘤生长数据。处死小鼠后以ELISA法检测肿瘤微环境中IL-12和IFN-γ水平,抽提肿瘤浸润淋巴细胞并以流式细胞术检测其中NK细胞数量的变化,瘤体组织切片以免疫组化法检测NKG2D表达水平的变化。结果:成功构建CD40sc Fv-p ET28a重组质粒,并经基因测序验证无误。SDS-PAGE电泳和His-tag Western blot检测证实CD40 sc Fv表达成功,蛋白大小约27k Da;纯化后所获得条带单一,BCA蛋白定量测得纯化蛋白样品浓度为1.122mg/ml。体外成功诱导分化小鼠DC细胞;CD40 sc Fv激活后的DC细胞MHC-II、CD80、CD86的表达水平分别为90.49%±3.77%、87.99%±3.35%和94.07%±3.13%,较阴性对照组明显上调(P=0.000,P=0.000,P=0.010)。CD40 sc Fv组DC细胞的培养上清中IL-12水平为555.86±40.48 pg/ml,较阴性对照组明显升高(P=0.000)。利用各组激活后的DC细胞及培养上清刺激NK细胞后,NK细胞培养上清IFN-γ水平为296.71±24.62 pg/ml,较阴性对照组明显升高(P=0.015)。CD40 sc Fv组NK细胞的对T6-17细胞杀伤能力为72.23%±3.99%,也较阴性对照组明显升高(P=0.004)。体内实验中成功构建Balb/c nude鼠的T6-17肿瘤模型,激动性抗小鼠CD40 sc Fv对Balb/c nude鼠的T6-17肿瘤模型生长有抑制作用,肿瘤最终生长体积相较于阴性对照组显著降低(P=0.000)。CD40 sc Fv组肿瘤微环境中IL-12和IFN-γ水平分别为188.801±32.718 pg/ml和121.428±30.994 pg/ml,均较NS组显著升高(分别为P=0.023和P=0.006)。CD40 sc Fv组TIL中CD3-DX5+细胞比例可达19.15%±2.24%,较NS组明显升高(P=0.002)。CD40 sc Fv组肿瘤组织NKG2D蛋白表达阳性率为8.18%±2.01%,其表达水平较NS组显著升高(P=0.005)。结论:(1)成功构建激动性抗小鼠CD40sc Fv的原核表达载体,并纯化获得高纯度的激动性抗小鼠CD40 sc Fv。(2)激动性抗小鼠CD40 sc Fv在体外加强小鼠DC细胞激活水平,上调其MHC-II、CD80、CD86的表达水平并加强其IL-12的分泌;被CD40 sc Fv激活的DC细胞可以加强NK细胞的激活水平,增加其IFN-γ的分泌并加强其杀伤能力。(3)激动性抗小鼠CD40 sc Fv在体内可以抑制Balb/c nude鼠T6-17肿瘤的生长,增加肿瘤微环境中IL-12、IFN-γ水平,巢集NK细胞到肿瘤微环境中并上调其激动性受体NKG2D的表达水平。