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翻译后修饰在DNA损伤修复尤其是在DNA双链断裂修复中发挥十分重要的作用。在DNA双链断裂后能够发生多种翻译后修饰,如磷酸化修饰,泛素化修饰和ADP-核糖基化修饰,这些修饰在DNA损伤修复过程中对多种生物学过程具有调控作用。已有研究表明,同其他翻译后修饰一样,DNA损伤后也能够引发蛋白质发生O-GlcNAc糖基化修饰（O-linked N-acetylglucosamine modification,O-GlcNAcylation）。蛋白质的O-GlcNAc糖基化修饰由O-GlcNAc转移酶（O连接的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶,OGlcNAc transferase,OGT）催化发生,OGT以UDP-GlcNAc为作用底物,可去除UDPGlcNAc上的UDP并通过O-连接的糖苷键将GlcNAc共价连接在靶向蛋白质丝氨酸或苏氨酸的侧链上。DNA损伤形成后,OGT能够被募集到DNA损伤位点并在DNA损伤处催化形成O-GlcNAc糖基化修饰。OGT介导的O-GlcNAc糖基化修饰在DNA损伤修复中发挥重要的作用。除了OGT,蛋白质的O-GlcNAc糖基化修饰也受到O-GlcNAc酶（O连接的N-乙酰氨基葡萄糖苷酶,O-GlcNAcase,OGA）的调控作用。OGA能够通过水解糖苷键将蛋白质苏氨酸或丝氨酸上连接的GlcNAc释放。然而已有研究对在O-Glc NA糖基化修饰中发挥“eraser”功能的O-GlcNAc酶（OGA）在DNA损伤修复中的功能仍然知之甚少。人体细胞中OGA由916个氨基酸构成,主要包含两个功能结构域,分别为位于N端的主要负责O-GlcNAc去除的催化结构域和位于C端的与组蛋白乙酰转移酶序列同源的HAT结构域,其中的HAT结构域因缺乏与乙酰辅酶A结合的关键氨基酸而缺失组蛋白乙酰转移酶活性。然而,因为OGA中功能缺失的HAT结构域在序列分析中呈现进化保守的特征,因此推测OGA的HAT结构域很有可能在OGlcNAc糖基化修饰去除的相关过程中扮演重要的角色。本研究围绕OGA在DNA损伤修复过程中的分子机制和生物学功能进行分析,得到如下成果:1.OGA介导DNA损伤反应中的O-GlcNAc糖基化修饰的去除对IR处理诱导DNA损伤后细胞内O-GlcNAc糖基化修饰的动态变化进行分析发现,O-GlcNAc糖基化修饰呈现出先增高后降低至正常水平的动态变化过程。使用OGA抑制剂（Thiamet-G,TMG）抑制OGA的酶活性或者si RNA敲低细胞内OGA的表达,DNA损伤后O-GlcNAc糖基化修饰的去除过程显著受到抑制。表明OGA介导DNA损伤后O-GlcNAc糖基化修饰的去除过程。激光微辐射实验中,DNA损伤后OGA能够被募集至DNA损伤位点,且OGA在DNA损伤位点的募集能够被OGT抑制剂（OSMI-1）阻碍。证明OGA通过识别DNA损伤位点处O-GlcNAc修饰底物形成募集,并通过介导底物的去糖基化过程参与DNA损伤修复过程。2.OGA的HAT结构具有调控O-GlcNAc糖基化修饰去除的功能由于OGA主要由两个结构域构成,因此我们进一步分析哪个结构域负责介导OGA到DNA损伤位点的募集。我们通过删除N端催化结构域或C端HAT结构域生成了两个截短的OGA突变体（C-OGA和N-OGA）。只有C-OGA而不是N-OGA可以重新募集到DNA损伤位点,表明OGA的HAT结构域介导了OGA在DNA损伤位点的募集。此外,我们用两种不同的OGA抑制剂TMG或（Z）-PUGNAC处理细胞,以阻断OGA的催化活性,发现OGA仍然能够募集到DNA损伤位点。这些结果表明,OGA在DNA损伤位点的募集主要由C端的HAT结构域而不是其催化结构域介导。3.OGA的催化结构和HAT结构都在DNA损伤修复中发挥重要作用由于OGA是唯一在DNA损伤后水解O-GlcNAcylation的酶,因此OGA很有可能在DNA损伤修复中起关键作用。为了研究OGA的催化结构域和HAT结构域在DNA损伤修复中的功能,通过使用si RNA敲低内源OGA的表达,并用全长OGA（OGA-FL）、N-OGA或C-OGA重构细胞,使用IR处理细胞以诱导DNA doublestrand break（DSB）。在中性条件下使用彗星实验测量DSB的修复动力学。实验表明敲低内源OGA的表达显着抑制了DSB的修复。此外,敲低内源OGA的表达后再次转入OGA的催化结构域（N-OGA）或HAT结构域（C-OGA）,细胞对IR诱导的DNA损伤均表现敏感,表明OGA的催化结构和HAT结构均在DNA损伤修复中起着重要的作用。使用不同剂量的IR处理细胞,并进行克隆形成实验以检查细胞活力。发现缺乏全长OGA或重要结构域的细胞均对DNA损伤高度敏感。这些结果表明OGA在DNA损伤修复过程中发挥作用,且HAT结构在DNA损伤修复中发挥作用。4.OGA的HAT结构具有识别底物的功能使用亲和纯化和质谱联用的方法分析OGA-HAT结构域的相互作用蛋白,发现非同源末端重组修复（NHEJ）因子NONO和Ku70/80复合物与HAT相关。NONO和Ku70/80复合物都能够在DNA双链断裂的NHEJ通路中发挥功能。实验验证了OGA的HAT结构域和NHEJ修复因子NONO和Ku70/80复合物之间具有相互作用,并验证了是OGA的HAT结构域（C-OGA）能够识别这些DNA损伤修复因子,而不是N-OGA。进一步实验分析证明,IR处理后,HAT结构与这些DNA损伤修复因子的相互作用增强。5.DNA损伤后OGA介导作用底物O-GlcNAc糖基化修饰的去除IR处理之后,NONO和Ku70/80复合物均可以形成O-GlcNAc糖基化修饰。对DNA损伤后不同时间点的取样分析发现底物的O-GlcNAc糖基化修饰在IR处理后即开始,并在DNA损伤后一段时间达到峰值后逐渐降低至正常水平。此外,通过TMG处理来抑制OGA的酶活性或通过si RNA处理降低OGA的内源表达,这些OGlcNAc糖基化修饰动态变化中的下降趋势都被显著抑制,表明OGA在DNA损伤修复过程中介导NONO和Ku70/80复合物的糖基化去除。此外,DNA损伤后,HAT相互作用底物的O-GlcNAc糖基化修饰水平显著提高,表明在DNA损伤后HAT结构域能够通过识别O-GlcNAc修饰的NONO和Ku70/80复合物发挥损伤修复作用。6.OGA对底物NONO O-GlcNAc糖基化修饰的去除作用调控其与染色质的相互作用并影响DSB修复中非同源末端重组修复通路的作用激光微辐射处理细胞后,NONO和Ku70/80复合物均能够快速募集在DNA损伤位点。使用TMG或者（Z）-PUGNAc抑制OGA的活性,其作用底物的O-GlcNAc糖基化修饰的去除过程被阻碍,将显著延长NONO在DNA损伤位点的维持,作为DSB的早期作用蛋白,NONO在IR处理细胞后应及时被降解,这对于促进后续修复因子的载入以进行下一步的修复是十分重要的。TMG处理细胞后,NONO的降解受到抑制,表明抑制NONO的O-GlcNAc糖基化修饰的去除将抑制NONO的降解。GFP报告基因检测实验发现TMG或者（Z）-PUGNAc抑制OGA活性能够使DNA损伤后NHEJ修复通路受到抑制。本研究发现DNA损伤后,OGA能够在DNA损伤位点形成募集,且其HAT结构域在OGA到DNA损伤位点的募集过程中发挥重要的作用。DNA损伤后,OGA通过其HAT结构域识别底物并与O-GlcNAc糖基化修饰的底物产生相互作用。研究鉴定出DNA损伤修复因子NONO和Ku70/80复合物均是OGA的相互作用底物。抑制OGA的酶活性,DNA损伤后的O-GlcNAc糖基化修饰恢复至正常水平的动态过程将受到阻碍,从而抑制NONO在DNA损伤位点处的降解并影响NHEJ修复通路。总的来说,研究表明OGA介导的O-GlcNAc糖基化修饰的去除能够对DNA损伤修复过程产生促进作用。