论文部分内容阅读
凋亡蛋白抑制因子家族是一类重要的抗细胞凋亡因子,该家族结构的共同特点是N端含有一个或多个串联的杆状病毒IAP重复序列,C端含或不含有一个环指结构。Survivin是IAP家族中的一个重要成员,具有强大的抗细胞凋亡作用,并在维持细胞有丝分裂以及血管形成过程中扮演重要角色。血管生成调节异常是恶性肿瘤的重要特征之一。研究提示,Survivin与多种人类肿瘤的血管形成有着密切的关系。脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤,其发生率约占颅内肿瘤的45%。尽管包括手术、放疗以及化疗在内的脑胶质瘤综合治疗水平在不断提高,但该病的治疗效果仍未得到明显的改善,恶性脑胶质瘤患者术后中位生存期尚不足一年。脑胶质瘤治疗困难的根源与其所具有的恶性生物学特性密切相关。研究表明,旺盛的血管形成是脑胶质瘤最重要的恶性表型之一。揭示参与脑胶质瘤血管形成的关键基因对于攻克这一顽疾有着重要的科学意义和临床应用价值。目前,Survivin在胶质瘤血管形成中的作用和机制尚不完全清楚,根据以往的研究结果,我们推测在胶质瘤中存在一个Survivin-促血管形成因子之间相互促进的正反馈调节通路,从而促进胶质瘤血管形成,导致肿瘤演进。基于此,本课题从以下三个方面进行了研究。1.促血管形成因子对胶质瘤细胞Survivin表达的影响目的探讨促血管形成因子VEGF、bFGF和PDGF对胶质瘤细胞系SHG44和U251中Survivin表达的影响。方法在体外培养的人胶质瘤细胞系SHG-44(无Survivin表达)和U251(高表达Survivin)培养液中分别加入重组人VEGF、bFGF和PDGF,每种细胞分为若干组,分别在含终浓度为0、25、50、100ng/ml VEGF,0、1、2.5、5、10、20 ng/ml bFGF和0、5、10、20、40ng/ml PDGF的DMEM培养液中培养24h后,收集各组细胞的总蛋白;同时,每种细胞分别在含终浓度为100ng/ml VEGF、10ng/ml bFGF、10ng/ml PDGF的培养液中培养0、6、24、48、72 h后,同样收集总蛋白。采用Western blot方法,检测以上各组Survivin基因蛋白表达水平。同前,每种细胞分别在含终浓度为100ng/ml VEGF、10ng/ml bFGF、10ng/ml PDGF的培养液中培养0、3、6、12、24 h后,提取各组细胞的总RNA。采用Real-time RT-PCR,检测各组Survivin基因RNA表达水平。结果PDGF能够在转录水平上上调SHG-44细胞和U251细胞Survivin基因的表达,并且这种上调作用呈现浓度和时间依赖性。对于SHG44,10ng/ml PDGF作用3h和12h,Survivin基因mRNA和蛋白表达水平分别达到高峰,此后逐渐下降,最低5 ng/ml水平的PDGF作用24h后即能上调SHG44细胞Survivin基因蛋白表达水平。对于U251,10ng/ml PDGF作用于6~12h和24~48h,Survivin基因RNA和蛋白表达水平分别达到高峰,此后逐渐下降,最低5ng/ml的PDGF作用24h后同样可见U251细胞Survivin蛋白表达水平升高。bFGF能够在转录水平上调U251细胞Survivin基因的表达,并呈现时间和浓度依赖性,而对SHG-44细胞无作用。10ng/ml bFGF作用于U251细胞6h和12~24h,Survivin基因mRNA和蛋白表达水平分别达到高峰,此后逐渐下降,低于10ng/ml的bFGF作用24h后未见Survivin蛋白表达水平提高。VEGF在设计的时间和浓度范围内对两种细胞Survivin基因的表达均无上调作用。结论血管形成因子bFGF和PDGF除直接刺激血管内皮细胞增殖、迁移而发挥促血管形成作用外,还可能通过Survivin基因介导的信号途径间接参与了胶质瘤的血管形成过程。2. Survivin基因真核表达载体和RNA干扰载体的构建、鉴定及细胞转染目的构建Survivin基因的真核表达载体和Survivin基因特异性RNA干扰载体,并分别转染人胶质瘤细胞系SHG44和U251,建立稳定转染细胞系。方法利用逆转录聚合酶链反应,扩增Survivin基因编码序列,扩增产物双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,成功构建Survivin基因真核表达载体pcDNA3.1-SVV。设计合成针对Survivin基因和针对荧火虫荧光素酶(FLF)基因特异性RNA干扰片断,后者作为针对人类基因的非靶向性无关插入序列,分别将两干扰片段连接入载体中,成功构建Survivin基因RNA干扰载体和无关序列载体。采用脂质体法,将pcDNA3.1、pcDNA3.1-SVV转染SHG44细胞,将pSilencer3.1-SVV、pSilencer3.1-FLF和pSilencer3.1-H1neo转染U251细胞,G418筛选稳定转染细胞系,采用Real-time RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学方法分别检测Survivin基因在转染细胞中的表达情况。结果酶切鉴定和核苷酸序列分析证实,成功构建了Survivin基因真核表达载体pcDNA3.1-SVV和Survivin基因RNA干扰载体pSilencer3.1-SVV;获得了稳定转染pcDNA3.1、pcDNA3.1-SVV、pSilencer3.1-SVV、pSilencer3.1-FLF和pSilencer3.1-H1neo的细胞系,分别命名为SHG44-P、SHG44-S、U251-S、U251-F和U251-P。经蛋白和RNA水平鉴定,SHG44-S细胞中Survivin基因稳定表达,U251-S细胞中Survivin基因表达受到明显抑制,抑制率为70%,SHG44-P细胞中无Survivin基因表达,U251-F和U251-P细胞中Survivin基因表达水平无明显变化。结论真核表达载体pcDNA3.1-SVV使Survivin基因在SHG44细胞中稳定表达。Survivin基因特异性RNA干扰载体pSilencer3.1-SVV能够明显抑制Survivin基因在U251细胞中的表达。这为Survivin基因促进胶质瘤细胞血管形成机制的研究奠定了实验基础。3.促血管形成因子在体外培养的稳转胶质瘤细胞中表达的变化目的比较基因转染前后胶质瘤细胞系SHG44和U251中三种促血管形成因子VEGF、bFGF和PDGF表达的变化,探索Survivin基因能否通过三种促血管形成因子介导参与胶质瘤血管形成过程。方法分别提取体外培养的SHG-44、SHG44-P、SHG44-S以及U251、U251-P、U251-F和U251-S细胞总RNA和总蛋白。采用Real-time RT-PCR、Western blot,分别检测三种促血管形成因子VEGF、bFGF和PDGF的mRNA和蛋白在各组细胞中的表达情况。收集各组细胞培养上清液,采用ELISA方法检测各组细胞三种促血管形成因子分泌水平。实验结果进行图像和统计学分析。结果蛋白水平,SHG44-S细胞胞浆和上清中出现bFGF表达而未见VEGF、PDGF表达,SHG44-P和SHG44细胞胞浆和上清中始终未见VEGF、bFGF和PDGF表达;U251-S细胞胞浆和上清中VEGF、bFGF表达水平明显下降,分别下降为转染前水平的50%和30%,PDGF表达水平无变化。然而,转染空白和无关序列载体后,U251-P和U251-F细胞VEGF、bFGF和PDGF蛋白表达水平均未见明显变化。mRNA水平结果与蛋白水平结果一致。结论上调Survivin基因表达,SHG44细胞中bFGF的表达从无到有;而抑制Survivin基因表达,U251细胞中VEGF、bFGF表达受到明显抑制。提示Survivin基因能够通过血管形成因子VEGF和bFGF的介导,参与胶质瘤血管形成过程,这为进一步研究Survivin基因参与的胶质瘤血管形成调控通路提供了依据。