一、研究背景细胞内的氧化还原状态对于细胞的存活及功能至关重要。参与细胞内氧化还原调节的活性氧(Reactive oxygen species, ROS)是细胞内主要的氧化剂(oxidants)。正常生理低水平ROS可作为第二信使分子,传递胞内细胞信号并参与细胞的各种生理活动如细胞代谢、增殖、分化与凋亡等。然而过多的ROS可损伤核酸、脂类、蛋白质等生物大分子,并使细胞处于氧化应激状态。较高水平或持续存在的氧化应激状态,可导致细胞内大分子的氧化修饰,或通过激活特定的细胞内信号转导通路,最终导致细胞损伤及异常死亡。ROS引起的细胞损伤与异常细胞死亡参与了多种人类重大疾病如癌症、神经退行性疾病、自身免疫疾病及衰老等的病理发生与进展过程,阐明ROS引起异常细胞死亡及相关疾病的发病机制对探索这些疾病新的防治方法具有重要意义。核因子-KB(nuclear factor-KB, NF-κB)信号通路在调节细胞存活及死亡过程中起重要作用。NF-κB是一种广泛存在于真核细胞内的基因多向性转录因子,属于Rel家族。在哺乳动物细胞中存在5种NF-κB成员,它们之间形成不同的同源或异源二聚体复合物。在大部分细胞中NF-κB复合物存在于胞质中,其活性受Iκ-Bs (inhibitors of NF-κB)蛋白家族抑制。作为NF-κB的上游分子,IKK的活化是激活NF-κB经典途径的关键步骤。IKK包括三个亚单位：IKK-a (IKK1)、IKK-β(IKK2)和IKK-γ(NEMO)。IKK-α和IKK-P是催化亚单位,IKK-γ是调节亚单位。目前已发现一些NF-κB和IK-B非依赖的IKK作用底物,因此IKK的激活可能介导了更广泛的信号通路,调控细胞更多的生物学进程。IKK/NF-κB通路活化后能够促进炎症的发生,细胞增殖以及抵抗凋亡,但最近也有研究发现NF-κB信号可促进细胞死亡。IKK在氧化应激中是否有促进细胞死亡的作用尚未有研究,IKK/NF-κB促进细胞死亡的分子机制仍不清楚。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是一种进化上高度保守的非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,属肌醇3-磷酸激酶(phosphoinositide3-kinase, PI3-K)蛋白激酶家族,是细胞代谢、生长增殖、存活与应激等生理过程的调节中心。mTOR在细胞内通过与其他多种蛋白形成两种不同的复合物(mTORC1与mTORC2)而发挥功能,雷帕霉素可特异性地抑制mTORC1。我们以往的研究表明ROS可时间、剂量与细胞依赖性地调节mTORC1信号通路,但ROS调节mnTORC1信号通路的分子机制还不清楚。S6K1是mTORC1的关键效应分子,在调节细胞生长、代谢、存活、肿瘤进展与衰老中起重要作用。S6K1有两种亚型,是由同一个转录子(mRNA)通过选择不同的翻译起始位点而得到的不同产物。p70S6K1,主要分布于细胞质中；p85S6K1N-端较p70S6K1多了一段由23个氨基酸残基构成的核定位信号(nuclear localization signal, NLS),被认为主要分布于细胞核内。mTORC1磷酸化p70S6K1Thr389位点或相应的p85S6K1Thr412位点是其活化的关键步骤。由于早期研究发现p70与p85可一致性地受生长因子与营养调节并发挥功能,多数研究集中在p70S6K1,对p85S6K1的调节与功能则知之甚少。mTORCl/S6K1一般被认为是促进细胞存活的,但最近研究也发现mTORC1/S6K信号可促进阿霉素或内质网应激引起的细胞死亡。而且,IKK信号与mTORCl信号之间存在相互调节。本研究旨在阐明IKK、mTORCl/S6K1在ROS引起细胞死亡中的作用并探讨其分子机制,为ROS引起细胞异常死亡及相关疾病发生的机制提供新的内容,为氧化应激引起相关疾病的防治提供新的靶点。二、研究结果1. IKK-β通过NF-κB非依赖途径介导H2O2引起的细胞死亡首先,采用siRNA敲低IKK-β的蛋白表达水平,能够显著抑制H2O2诱导的乳腺癌MCF-7细胞死亡：对照组(negative control, NC)细胞的死亡率为83.2%,而IKK-β siRNA干扰组死亡率为35.3%(P<0.05),但敲低IKK-α却没有类似的保护作用,其细胞死亡率与NC组类似(P>0.05)。其次,使用IKK特异性抑制剂预处理MCF-7细胞,同样能显著缓解H2O2诱导的细胞死亡(P<0.05)。再者,在MCF-7细胞中过表达HA-IKK-β能使细胞对H2O2诱导的死亡更敏感,而过表达HA-IKK-a却没有类似的现象。IKK-β siRNA下调IKK-β表达并显著抑制H202引起的细胞死亡的结果在Hela, HCT116细胞中也得到验证(P<0.05)。这些结果提示,IKK-β而不是IKK-α在H2O2诱导的细胞死亡中起关键作用。我们进一步探讨氧化应激中IKK-β促进的细胞死亡是否由其经典下游信号NF-κB介导。蛋白酶体抑制剂MG132可以通过抑制其抑制分子IKB-α的蛋白酶解从而阻止NF-κB的转位和激活,然而MG132并不能阻止H2O2诱导的细胞死亡。再者,利用p65siRNA敲低MCF-7细胞内p65蛋白水平同样未能降低H2O2诱导的细胞死亡(P>0.05)。这些研究表明,IKK-β可通过NF-κB非依赖途径介导H2O2引起的细胞死亡2.p85S6K1而不是p70S6K1以雷帕霉素非依赖途径介导H2O2诱导的细胞死亡我们进一步探讨IKK-β介导H202引起细胞死亡的机制。最近有报道发现IKK信号通路与mTORC1通路之间有相互调节。为研究mTORCl/S6K1在ROS引起细胞死亡中的作用,我们首先采用mTORC1抑制剂雷帕霉素预处理细胞,发现雷帕霉素处理不能阻止H202诱导的细胞死亡,也不能抑制HA-IKK-β过表达引起的细胞死亡增加。接着,采用siRNA干扰mTOR或Raptor (mTORC1成员)的表达,同样不能减少H202诱导的细胞死亡。再者,敲低细胞中的Rheb(mTORC1上游活化因子)蛋白表达水平以抑制mTORC1信号,也不能使细胞抵抗H202诱导的死亡(P>0.05)。然而,采用siRNA敲低MCF-7细胞S6K1的水平能显著抑制H2O2诱导的细胞死亡：NC组细胞的死亡率为83.2%而S6K1siRNA干扰组细胞死亡率为36.7%(P<0.05)。由于S6K1siRNA能同时敲低p70与p85S6K1的蛋白表达水平,为研究p70与p85S6K1在这一过程中的作用,我们进一步在MCF-7细胞中分别过表达两种蛋白。结果发现过表达p85S6K1而不是p70S6K1能显著促进H2O2诱导的细胞死亡(P<0.05)。以上结果表明在H202诱导的细胞死亡中,p70S6K1和p85S6K1具有不同的功能,p85S6K1而不是p70S6K1能够以雷帕霉素不敏感、mTORC1非依赖途径促进细胞死亡3.H2O2通过雷帕霉素不敏感途径激活p85S6K1而不激活p70S6K1为研究p70与p85S6K1的不同功能,我们检测了H2O2对p70(T389)与p85(T412)S6K1磷酸水平的影响。我们发现,在雷帕霉素存在的条件下,H2O2可时间与剂量依赖地引起p85S6K1(T412)磷酸化水平增加,也就是说H2O2引起的p85S6K1(T412)磷酸化是雷帕霉素非依赖的,但p70S6K1(T389)磷酸化水平却没有增强。同样,以mTOR激酶活性抑制剂Pp242(同时抑制mTORC1/2)预处理细胞也不能阻止H202引起的p85S6K1(T412)磷酸化水平的增加。这些结果在MCF-7、Hela、HCT116等多种细胞中得到进一步证实。相应地,S6K1底物分子S6(S235/236)的磷酸化在这些条件下也被上调,且过表达p85而不是p70S6K1可促进H202引起的雷帕霉素非依赖的P-S6(S235/236)增加。体外激酶活性实验进一步证实,p85S6K1而不是p70S6K1负责H2O2引起的雷帕霉素不敏感的S6(S235/236)磷酸化。因此,H2O2可以通过雷帕霉素不敏感、mTOR激酶活性非依赖的途径激活p85S6K1而不是p70S6K1。4.氧化应激条件下IKK-β参与雷帕霉素非敏感的p85S6K1的活化由于IKK-β与p85S6K1均在H2O2引起细胞死亡中起重要作用,我们推测IKK-β可能参与了H2O2引起mTORC1非依赖的p85S6K1活化。我们发现H2O2能激活IKK信号通路,因为H2O2能增强IKK-α/β(S176/180)的磷酸化水平,同时促进IKB-α的降解,且具有时间依赖性。另外IKK的特异性抑制剂wedelolactone,而不是PI-3K的抑制剂Ly294002能够抑制在雷帕霉素存在下H202引起的p85S6K1(T412)和S6(S235/236)的激活。同时采用si RNA敲低IKK-β而不是IKK-α的表达能够显著抑制H202引起的雷帕霉素不敏感的p85S6K1(T412)和S6(S235/236)的磷酸化水平。因此,IKK-β参与了H2O2引起的mTORC1非依赖的p85S6K1活化。5. IKK-β与p85S6K1而不与p70S6K1相互作用IKK-p在H2O2引起mTORC1非依赖的p85S6K1活化中起关键作用提示,IKK-β可能与p85S6K1相互作用并直接磷酸化p85S6K1。确实,免疫共沉淀试验发现,外源表达的IKK-β的免疫沉淀物中可以同时检测到p85S6K1的存在。这一结果在内源性IKK-β的免疫共沉淀试验中得到进一步确认。免疫荧光染色也显示IKK-β与p85S6K1在胞质中存在共定位。免疫荧光染色与细胞组分分离(fractionation)也证实无论是外源表达还是内源性p85S6K1与p70S6K1都主要分布在细胞质中,细胞核也有少量表达。这些结果提示IKK-β与p85S6K1存在相互作用。我们进一步通过IKK-β的体外激酶实验检测IKK-β是否可直接磷酸化p85S6K1。令人遗憾的是,活化的IKK-β可在体外磷酸化其传统底物GST-IκB-α(S32/36),但不能磷酸化细菌表达并纯化的his-p85S6K1及his-p70S6K1。这些结果表明,可能存在其他未知激酶负责氧化应激条件下mTORC1非依赖的p85S6K1磷酸化,但IKK-β在这一过程中也起关键作用,可能作为衔接蛋白募集其他激酶或负责磷酸化激活其他未知激酶。6. IKK-β通过激活p85S6K1-Mdm2-p53信号通路介导H20O引起的细胞死亡我们进一步研究了IKK-β-p85S6K1在介导H2O2引起细胞死亡中的作用与分子机制。我们发现,采用siRNA下调S6K1可以阻止氧化应激中因IKK-β过表达促进的细胞死亡；过表达p85而不是p70S6K1可恢复IKK-β敲低引起的细胞死亡减少,这些研究证明p85而不是p70S6K1介导了氧化应激中IKK-β促进细胞死亡的功能。最近一项研究发现,小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)中S6K1可与Mdm2相互作用并磷酸化其S163位点,进一步阻止其进入细胞核参与p53的泛素化降解,从而引起p53的累积与细胞死亡。我们检测到H2O2也可以促进Mdm2(S166)(human)的磷酸化,并且具有浓度依赖性,该位点相当于鼠的S163位点。尽管Mdm2的蛋白表达水平因雷帕霉素处理而略微减少,但H202仍能在雷帕霉素存在的情况下磷酸化Mdm2(S166)。再者,siRNA敲低IKK-p或S6K1可以抑制Mdm2(S166)的磷酸化。过表达IKK-β和p85S6K1可以增强Mdm2(S166)的磷酸化水平,但过表达p70S6K1却不能使Mdm2(S166)磷酸化水平增强。这些发现揭示,氧化应激条件下IKK-β-p85S6K1能够以雷帕霉素不敏感的方式磷酸化Mdm2(S166)。进一步研究发现H2O2处理MCF-7细胞可增加p53蛋白的水平,并且具有时间依赖性；但这种蛋白水平的增加可因IKK特异性抑制剂wedelolactone预处理细胞而受抑制。同样的,siRNA敲低IKK-β或S6K1也能抑制H2O2诱导的p53积累。这些结果提示IKK-β和p85S6K1在H2O2诱导p53积累中起重要作用。此外,siRNA敲低p53表达能显著抑制H2O2引起的细胞死亡,并且采用siRNA同时敲低p53及S6K1或IKKβ水平同样可阻止H2O2引起的细胞死亡,且其保护效果与单独敲低p53、S6K1和IKKβ表达水平相当,提示p53介导了氧化应激中IKK-β或p85S6K1促进的细胞死亡。因此,IKK-β可能通过激活p85S6K1-Mdm2-p53信号通路介导H202引起的细胞死亡。三、结论综上所述,我们的研究揭示了一条新的涉及IKK-β、p85S6K1、Mdm2与p53氧化应激反应信号转导通路。通过这条通路,ROS激活IKK-β进而以mTORC1非依赖的方式激活p85S6K1,活化的p85S6K1进一步磷酸化Mdm2(S166)从而上调p53,最终导致细胞的死亡。IKK-β促进细胞死亡的作用为IKK-β的功能及其调节机制增添了新的内容,IKK-β是否能成为防治ROS引起异常细胞死亡相关疾病如癌症的靶点,以及其抑制剂对于治疗神经退行性疾病和衰老相关疾病中的效果有待进一步的研究。