宫颈癌(cervical cancer,CC)的发生是一个连续的过程，是由宫颈上皮内瘤样病变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)进展演变而来。探讨CIN进展的分子机制对宫颈癌的预防和治疗都具有特别重要的意义。CIN是指宫颈癌前病变至原位癌的连续过程，依据宫颈上皮细胞不典型增生的程度分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级。肿瘤浸润和转移是一个受多因素调节、多步骤的复杂过程：瘤细胞从原发灶脱离，穿过细胞外基质(extracelluar matrix，ECM)屏障、血管壁基底膜(basement membrane，BM)进入血液循环，最后穿出血管壁进入新宿主微环境形成转移灶。瘤细胞可产生和(或)诱导间质细胞产生多种蛋白酶降解ECM、血管壁BM，促进浸润转移。基质金属蛋白酶(matrix metallopmteinases，MMPs)是其中最为重要的一组，它为锌依赖性内切酶家族，几乎能降解 ECM 中所有成分。基质金属蛋白酶-2 (matrix metalloproteinase-2,MMP-2)，又称为明胶酶A，与乳腺癌、胃癌、直肠癌、脑膜胶质瘤等多种肿瘤的浸润转移及预后密切相关，其在宫颈癌发生、发展中的作用也逐步受到重视，但其临床意义尚不明确。基质金属蛋白酶的组织抑制物(tissue inhibitor ofmatrix metalloproteinasesTIMPs)是MMPs的天然抑制剂，与MMPs结合可抑制其活性，也具有诱导细胞凋亡、促进血管生成等作用。TIMP-2是MMP-2的天然抑制剂，与MMP-2形成1∶1复合物，通过结合及抑制MMP-2活性来抑制肿瘤细胞的侵袭。MMP-2与TIMP-2间的平衡在调节ECM稳态中起重要作用，MMP-2FFIMP-2比率失衡是肿瘤恶变和转移的重要原因。但MMP-2及TIMP-2在CIN各级中的表达情况，研究结果不完全一致，因而有必要进一步探讨。本研究采用CIN诊断明确的病理标本，应用免疫组化方法，观察MMP-2和TIMP-2蛋白在各级CIN中的表达情况。 研究目的 研究基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及其组织抑制物(TIMP-2)在CIN中的表达，探讨其在CIN进展中的作用。 材料与方法 1．标本来源 选取深圳市第五人民医院2005年12月～2006年12月活检的CIN和柱状上皮移位组织标本51例。患者年龄28-49岁，年龄平均(32.2±5.4)岁。所有病例术前均未实行放化疗，资料完整，且经病理证实。全部标本经10％福尔马林固定，石蜡包埋。患者术前HPV(HC-2检测)均为阳性。 2．实验分组 所选病例随机分为4组：柱状上皮移位组10例、CINⅠ组9例、CINⅡ组18例、CINⅢ组14例。 3．实验试剂 MMP-2单克隆抗体(CA4001，浓缩型，1∶40)购自福州迈新生物技术开发有限公司。TMP-2多克隆抗体(即用型)，通用型SP试剂盒(即用型)、DAB试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。 4.免疫组化检测 采用S-P法染色，切片常规脱蜡水化后，加入过氧化物酶阻断溶液阻断内源性过氧化物酶的活性，抗原修复后加入第一抗体，4℃冰箱过夜后，加入生物素标记的第二抗体，室温下孵育后再加入链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片。空白对照用PBS代替一抗，阳性对照采用绒毛组织。 5.结果判断 免疫组化染色结果按照盲法由一位有经验的病理医师独立进行判断。光学显微镜下观察并摄片，见细胞浆中出现明确的棕黄色颗粒的细胞为阳性信号。阳性信号采用Image-pro-plus 5.0图像分析系统进行定量分析，MMP-2和TIMP-2免疫反应产物的标记用光密度(A)表示，在镜下随机选取5个视野，每个视野系统自动随机测定3个不同的部位，提取阳性细胞，测定MMP-2和TIMP-2的A值。 6.统计分析 数据采用SPSS10.0统计软件处理，实验数据符合正态分布者用均数±标准差表示，正态数据多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用最小显著差异法(LSD，Least significant Difference)检验，非正态数据两组间比较采用Wilcoxon秩和检验，采用pearson进行相关分析，取P<0.05为检验标准。 实验结果 1.MMP-2、TIMP-2在柱状上皮移位及CIN中的表达 MMP-2在柱状上皮移位组及CIN Ⅰ组、CIN Ⅱ组、CIN Ⅲ组中的平均光密度值(A)分别为：0.018±0.004，0.025±0.008，0.034±0.011，0.047±0.013。T1MP-2在柱状上皮移位组及CIN Ⅰ组、CIN ⅡN、CIN Ⅲ组中的平均光密度值(A)分别为：0.075±0.011，0.084±0.015，0.088±0.013，0.106±0.025。MMP-2的表达在CIN Ⅲ组高于柱状上皮移位组、CIN Ⅰ组及ClN Ⅱ N(P<0.05)，在CIN Ⅱ组高于柱状上皮移位组及CIN Ⅰ组(P<0.05)，柱状上皮移位组与CIN Ⅱ组之间，差异无统计学意义(P>0.05)。TIMP-2的表达在CIN Ⅲ组高于柱状上皮移位组、CIN Ⅰ组及CINⅡ组(P<0.05)，柱状上皮移位组、CIN Ⅰ组及CIN Ⅱ组各组间差异无统计学意义(P>0.05)。 2.柱状上皮移位及CIN中MMP-2/TIMP-2的光密度比值 MMP-2/TMP-2的光密度比值在柱状上皮移位组及CIN Ⅰ组、CINⅡ组、CIN Ⅲ组中分别为：0.238±0.019，0.301±0.011，0.404±0.028，0.478±0.021。MMP-2/TIMP-2的比值，在CIN Ⅲ组高于柱状上皮移位组及CIN Ⅰ组(P<0.05)，在CIN Ⅱ组高于柱状上皮移位组(P<0.05)，CIN Ⅲ组与CINⅡ组之间，CINⅡ组及CIN Ⅰ组之间，CIN Ⅰ组及柱状上皮移位组之间，差异无统计学意义(P>0.05)。 3.MMP-2和TIMP-2在CIN中表达的相关性 在CIN组织中，随着CIN分级的升高，MMP-2表达上调，TIMP-2的表达也上调，但两者的pearson相关系数=0.241，不能认为MMP-2表达与TIMP-2的表达有相关性(P>0.05)。 在CIN中，随着CIN分级的升高，MMP-2、TIMP-2的表达水平上调，尤其是MMP-2/TIMP-2比率失衡，与CIN的生物学行为密切相关，在判断CIN的潜在恶性程度、估计其预后中有一定意义。