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知母-黄柏是一种常用的经典药对,最早出自金·李杲的《兰室秘藏》,方名“通关丸”,又名“滋肾丸”,在不少的经典方剂中均有体现,如“滋肾通关丸”、“知柏地黄丸”等。知母为百合科植物知母(Anemarrhena asphodeloides Bge.)的干燥根茎,具有清热泻火和滋阴润燥的功效。黄柏(川)为芸香科黄皮树(Phellodendron chinese Schneid.)干燥树皮,具有清热燥湿、泻火解毒、疗疮的功效。知母和黄柏两药配伍运用,既相互促进,又相须互补,相辅相成共奏清热燥湿、养阴降火之功。现代药理研究表明知母所含的皂苷类、黄酮类及知母多糖类等成分具有显著的降糖、降脂及抗炎作用;而黄柏的主要有效物质为总生物碱,又以小檗碱为主,具有明显的降血糖、降血脂、抗炎及免疫调节、促进小鼠抗体生成等作用。本课题以知母-黄柏药对有效部位群(主要为总皂苷类、总生物碱类)为研究对象,在国内外研究现状及前期实验的基础上,从胰岛素相关信号通路IRS-1/PI3K/AKT出发探讨其降糖、改善认知障碍的作用机制,为进一步将其开发为一种安全、有效、可控的降糖和改善糖尿病认知障碍的药物提供参考依据。方法:雄性SD大鼠80只,SPF级,随机每组10只,分为8组,分别是:正常组(NC组),痴呆模型组(AD组),糖尿病模型组(DM组),复合模型组(AM组),AM-盐酸美金刚组,AM-盐酸-二甲双胍组,AM-知柏有效部位群高剂量组及低剂量治疗组。采用STZ+高脂饲料诱导的2型糖尿病模型、灌胃AlCl3诱导的痴呆模型以及STZ+高脂+AlCl3诱导的复合模型,通过连续灌胃知母黄柏药对有效部位群提取物后,分别在给药8周、16周时,测定血浆GLU、TC、TG、INS、Aβ1-42等指标检测每组大鼠的血液生化指标的水平,并结合Barnes迷宫试验和Morris水迷宫实验分析其行为学改变。在给药20周结束,解剖保存大鼠各组织器官,其中大鼠胰腺组织和海马组织作形态学观察,并通过实时荧光定量PCR法和蛋白免疫印迹法(WB,western blot法)检测大鼠脑组织IRS-1、PI3K、AKT、Bcl-2、Bax蛋白表达。结果:1.Ⅱ型糖尿病模型组与正常组相比,体重先升高,在注射STZ 3周后明显下降,而空腹血糖显著升高(P<0.05),提示实验性Ⅱ型糖尿病诱导成功。2.给药8周、16周时大鼠FPG、TC、TG水平:与对照组相比,DM和AM模型组大鼠FPG、TC、TG均显著性升高,有统计学意义(P<0.01或P<0.05);与DM和AM模型组相比,知母黄柏药对有效部位群能显著抑制模型组FPG、TC、TG的升高(P<0.01或P<0.05);而AD模型组与正常组相比,FPG无显著差异,但是TC、TG有差异(P<0.01或P<0.05)。3.给药8周、16周行为学试验结果表明:在Barnes实验、Morris水迷宫实验过程中,与对照组相比,3个模型组的寻找目标洞或目标区域的潜伏期均具有统计学意义(P<0.001或P<0.01或P<0.05),表明随着造模时间的增加,模型组的大鼠逐渐表现出认知、行为、记忆方面的障碍;与模型组相比,各给药组均表现不同程度的改善大鼠记忆的能力,其中盐酸美金刚组、知柏药对给药组疗效显著(P<0.01或P<0.05),且总体来看,知柏高剂量组优于低剂量给药组。4.给药8周、16周Aβ1-42蛋白水平结果表明:随着造模及给药周期的增加,与对照组相比,各模型组表现出显著差异(P<0.01),提示Aβ1-42蛋白水平是一个逐渐积聚的过程;与模型组相比,盐酸美金刚组、知柏药对高剂量给药组对Aβ1-42蛋白水平具有一定的改善(P<0.05)。5.给药20周INS水平结果表明:与对照组相比,各模型组外周胰岛素水平和中枢胰岛素水平均表现出显著差异(P<0.001或P<0.01或P<0.05);与模型组相比,知柏药对给药组改善胰岛素水平方面优于阳性药组。6.胰腺组织HE染色结果显示:对照组大鼠胰腺的腺泡细胞包膜完整,胰岛团为圆形或卵圆形,胞核清晰,每个胰岛团内细胞数量较多且胞质丰富;AD、DM和AM模型组大鼠胰岛细胞坏死明显、排列紊乱,局部炎性细胞灶性浸润伴胰岛细胞严重水肿,部分细胞气球样变,具铁血黄素沉积,部分小叶内导管蛋白管型;知母-黄柏有效部位群给药组大鼠胰腺细胞呈轻度水肿,细胞排列较模型组有序,胰腺细胞坏死减轻,少量细胞气球样变,相对模型组具修复作用,且呈量效关系。7.海马CA1区HE染色结果显示,对照组大鼠海马区神经元排列整齐,细胞体积较大,形态规则,着色均匀,细胞核大而圆;3个模型组海马神经元数量减少,大量细胞核固缩,尼氏小体数量减少,可见固缩状的坏死神经元,小胶质细胞增多,神经元细胞排列紊乱,知母-黄柏药对有效部位群给药组海马神经元数量丢失较模型组轻,神经元细胞排列较模型组有序,但仍可见少量固缩状的坏死神经元。8.脑组织中PI3KmRNA、AKTmRNA、Bcl-2mRNA水平结果:与对照组大鼠比较,模型组大鼠PI3KmRNA、AKTmRNA表达呈现下调趋势,而Bcl-2mRNA表达明显下调(P<0.05);与模型组相比,盐酸美金刚组、知柏高剂量组可以显著上调 PI3KmRNA、AKTmRNA、Bcl-2mRNA 的表达(P<0.01 或 P<0.05);知柏低剂量组大鼠对P13K、AKTmRNA表达上调不明显,可上调Bcl-2mRNA的表达(P<0.05),表明了知柏药对有效部位群可有效抑制细胞凋亡,修复神经损伤,有可能是通过激活PI3K/AKT途径实现的。9.脑组织中IRS-1、PI3K、AKT、Bcl-2、Bax蛋白表达结果:与对照组相比,AD和AM模型组,IRS-1、AKT蛋白表达显著下调(P<0.001或P<0.01或P<0.05);其中,AD模型组PI3K、Bcl-2蛋白表达明显下调(P<0.001或P<0.01),而促凋亡Bax蛋白表达显著增加(P<0.01);DM模型组蛋白表达普遍增强(P<0.001或P<0.01或P<0.05);与模型组相比,知柏药对有效部位群给药组IRS-1、P13K、Bcl-2蛋白表达显著上调(P<0.001或P<0.01或P<0.05);Bax蛋白表达均显著下调(P<0.001或P<0.01),提示经给药知柏药对有效部位群后,可有效抑制脑组织神经细胞凋亡且呈剂量依赖性。结论:1.知母-黄柏药对有效部位群对STZ+高脂诱导的Ⅱ型糖尿病模型、灌胃AlCl3诱导的痴呆模型以及STZ+高脂+AlC13诱导的复合模型大鼠的糖脂代谢有明显的调节作用;对糖尿病模型引起的认知功能障碍具有明显的改善作用。2.知母-黄柏有效部位群能明显降低Aβ1-42蛋白的积聚,上调PI3K、AKT的蛋白水平,增强Bcl-2的蛋白表达,抑制促凋亡基因Bax的蛋白表达,对海马神经元和胰腺细胞损伤均有修复和保护作用,且结合荧光定量PCR与WB实验结果,显示mRNA水平的变化趋势与相应的蛋白表达是基本一致的。因此,本文推测,知柏药对有效部位群可影响大鼠神经系统IRS-1/PI3K/AKT/Bcl-2信号系统,对糖尿病大鼠引发的神经凋亡、认知障碍产生作用。