长链非编码RNA在骨肉瘤患者中的差异表达研究

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目的:1ncRNA在基因调控中起重要作用,目前它对骨肉瘤的发病机制的影响仍不清楚。本研究利用微矩阵基因芯片技术研究1ncRNA在骨肉瘤和癌旁组织表达谱的差异并初步探讨其生物学作用。方法:分别取9例骨肉瘤癌组织和对照癌旁组织,提取总RNA后进行质量测定,合格后杂交合成cDNA后经过Microarray基因芯片扫描仪扫描后得到原始数据,原始数据经过统计软件转换后进行统计分析,得到两种组织之间1ncRNA和mRNA的差异表达谱。分别选取上调的1ncRNA6个:ASLNC21868,ASLNC22124, ASLNC23844, ASLNC24587, BE503655, BC050642,下调的1ncRNA4个:ASLNC00339, ASLNC11435, ASLNC13387, ASLNC18814采用SYBR GREEN I实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)验证,并用GAPDH做内参。综合NCBI RefSeq, UCSC, RNAdb, LncRNAs等数据库资源,对芯片结果进行Gene Ontology、Pathways分析等初步生物信息学分析,并通过计算Pearson相关系数(≥0.95)建立1ncRNA与靶基因的基因网络图。结果:将差异表达的标准设为:Folgchange值≥2,P值≤0.05,发现两种不同组织芯片表达有明显差异。骨肉瘤组织与对照癌旁组织相比,在检测的1ncRNA表达谱中,9例样本平均上调的lncRNAs为3528个(从2723到4537),平均下调的1ncRNAs为3958(从3469到4368),其中在9例样本都上调的1ncRNAs403个,都下调的1ncRNAs798个,上调倍数最大的是ASLNC02724,7.23倍,下调倍数最大的是ASLNC05129,27.39倍。上调的1ncRNAs略少于下调的1ncRNAs。在检测的mRNA表达谱中,9例样本平均上调的mRNAs为2604个(从1394到3710),平均下调的mRNAs为2344(从1513到2867),其中在9例样本都上调的mRNAs986个,都下调的mRNAs933个。采用SYBR绿色荧光染料(SYBR GREENI)实时检测的聚合酶链反应(RT-PCR)验证表达上调的6个1ncRNAs: ASLNC21868, ASLNC22124, ASLNC23844, ASLNC24587, BE503655, BC050642,表达下调的4个1ncRNAs:ASLNC00339, ASLNC11435, ASLNC13387, ASLNC18814, RT-PCR结果显示ASLNC21868, ASLNC22124, ASLNC23844, ASLNC24587, BE503655, BC0506426个基因表达上调,ASLNC00339, ASLNC11435, ASLNC13387, ASLNC188144个基因表达下调,和芯片结果基本吻合。GO (Gene Ontology)分析显示,在上调表达的mRNAs中,cell adhesion、 extracellular matrix和protein binding分别在生物学进程(ontology: biological process)、细胞组件(ontology:cellular component)和分子功能(ontology:molecular function)三个方面富集程度最高,提示这些上调的mRNAs与这三者相关程度最高;在下调表达的mRNAs中,muscle system process、contractile fiber和structural constituent of muscle分别在生物学进程(ontology:biological process)、细胞组件(ontology:cellular component)和分子功能(ontology:molecular function)三个方面富集程度最高,同样提示这些下调的mRNAs与这三者相关程度最高。Pathways分析显示,在骨肉瘤组织中有32条通路(pathway)受下调的mRNAs调控,富集程度最高的是通路"Hypertrophic cardiomyopathy-Homo sapiens (human)”由24个目的基因组成;有34条通路(pathway)受上调的mRNAs调控,富集程度最高的是通路"ECM-receptor interaction-Homo sapiens (human)"由22个目的基因组成。我们选取了6个表达下调的lncRNA:ASLNC00339, ASLNC04683, ASLNC08248, ASLNC11435, ASLNC13387, ASLNC23339和6个表达上调的1ncRNA:ASLNC02419, ASLNC21868, ASLNC23844, ASLNC24079, BE050642, BE503655,通过计算与目的基因的Pearson相关系数(≥0.95),得到227个目的基因并共同建立编码-非编码基因共表达网络(coding-noncoding gene co-expression network)。结论:(1)1ncRNA microarray基因芯片是筛选骨肉瘤差异表达基因一种理想有效的方法;(2)首次利用1ncRNA microarray基因芯片揭示在骨肉瘤中存在异常表达的1ncRNA基因,利用实时荧光定量PCR对异常表达的部分1ncRNA基因进行验证进一步提高了芯片结果的可信度,生物信息学初步分析显示这些1ncRNA在骨肉瘤的发生发展中发挥复杂的调控作用:(3)1ncRNA可能是全新的骨肉瘤肿瘤标记物和潜在的基因治疗靶点
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