目的纳米通道生物传感器以其独特的三维纳米空间结构,可实现对分析物免标记、高灵敏度的检测,其在中药质量控制及新冠病毒检测新方法的开发和应用值得探索。重金属铅作为有毒重金属,2020年版《中国药典》已将其收录作为中药质量的关键评价指标。重金属铅传统的检测方法存在选择性较差、灵敏度低等不足,因此,开发高灵敏度及高特异性的重金属铅检测技术意义重大。目前全球新冠肺炎大流行,没有成熟的治疗方法,公共卫生干预措施主要是以预防及限制病毒传播为主,所以针对新冠病毒的早期检测成为了控制疫情传播的关键。但新冠的传统检测方法存在样本周转时间长、操作人员及检测环境要求高等不足,所以开发新的新冠病毒检测方法值得研究。基于此,本论文通过构建功能化的纳米通道生物传感器,实现对中药中重金属铅及新冠病毒免标记、高灵敏的检测,并在此基础上,将其用于监测中药活性成分抑制新冠假病毒作用,为中药质量控制、新冠病毒检测及中药抗新冠病毒研究提供了新方法。方法1.本章以氧化铝纳米通道为基材,连接与重金属铅特异性结合的肽链作为探针,由此构建肽链修饰的氧化铝纳米通道生物传感器对中药中的重金属铅进行免标记的高灵敏度检测。首先将氧化铝纳米通道进行酸化和漂洗,接着依次使用3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）和戊二醛（GA）对氧化铝纳米通道表面依次进行修饰使纳米通道表面醛基化,随后探针肽链通过醛胺缩合反应共价修饰到氧化铝纳米通道表面,采用BSA进行封闭后完成传感器的构建,最后靶标铅离子与肽链特异性结合实现检测,并将该方法应用到中药中重金属铅的检测中。利用皮安计电流电压法、X射线光电子能谱（XPS）、接触角（CA）分析、场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）和圆二光色谱法（CD）法对各修饰过程及靶标的捕获进行表征。通过检测一系列已知浓度的铅离子考察肽链修饰的氧化铝纳米通道生物传感器的灵敏度和线性范围;通过检测不同离子As3+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Cu2+、Fe3+、Hg2+、Mg2+、Mn2+、Ni2+、Zn2+考察该生物传感器的特异性;选择四种常用肽链修饰的氧化铝纳米通道生物传感器检测中药中重金属铅的性能。2.本章通过制备PET锥形纳米通道,连接新冠病毒S蛋白抗体作为探针修饰在纳米通道上,对新冠病毒实现免标记、高灵敏度检测。首先采潜径迹-不对称化学蚀刻法制备PET锥形纳米通道,接着通过NHS/EDC活化纳米通道表面羧基,将新冠病毒S抗体共价结合到纳米通道表面,用BSA封闭未反应的结合位点后完成抗体修饰的PET锥形纳米通道生物传感器的构建,最后靶标新冠病毒S蛋白与肽链特异性结合实现检测,并将该方法用于咽拭子样本中的新冠病毒S蛋白及新冠假病毒的检测中。利用皮安计电流电压法、XPS、CA分析、FE-SEM、激光共聚焦显微镜（LSCM）对各修饰过程及靶标的捕获进行表征;并利用表面等离子共振法（SPR）考察了新冠病毒S蛋白抗体与新冠病毒S蛋白的亲和力;通过检测一系列的相同浓度不同病毒蛋白包括MERS-Co V S、MERS-Co V N、H1N1、SARS N,考察该传感器的特异性,并采用表面声波传感SAW和流式细胞仪对新冠病毒S蛋白抗体与新冠病毒S蛋白的特异性结合进一步进行验证;通过检测一系列已知浓度的新冠病毒S蛋白考察新冠病毒S蛋白抗体修饰的锥形PET纳米通道生物传感器在1×PBS的灵敏度和线性范围;为满足临床需要,通过检测一系列已知浓度的新冠病毒S蛋白考察新冠病毒S蛋白抗体修饰的锥形PET纳米通道生物传感器在咽拭子中的灵敏度和线性范围;并考察了该生物传感器区分新冠假病毒和正常样本的能力。3.本章研究在上章基础上,利用构建的PET锥形纳米通道生物传感器监测中药活性成分抑制新冠病毒。首先构建ACE2高表达的293T细胞,并采用q RT-PCR和Western blot（WB）法进行验证;利用Auto Dock Tools 1.5.6对5种中药活性成分（白术内酯Ⅰ、丹酚酸B、黄芩素、小檗碱和槲皮素）与ACE2蛋白靶标进行分子对接分析,并利用Py Mol软件将中药活性成分与新冠病毒S蛋白之间的结合相互作用可视化为3D模型;采用CCK-8法筛选5种中药活性成分的给药浓度;将明确浓度的丹酚酸B和黄芩素与293T细胞共孵育6 h,加入相同浓度SARS-COV-2假病毒混合室温作用48h,随后采用荧光显微镜观察荧光强度变化,考察中药活性成分抑制新冠病毒感染靶细胞情况;最后将制备好的锥形PET纳米通道生物传感器对中药活性成分抑制假病毒作用进行监测,通过比较电流变化率绝对值考察中药抑制新冠病毒作用情况。结果1.皮安计电流电压曲线、XPS、CA分析、FE-SEM和CD法结果均证明肽链的成功修饰,铅离子成功被肽链捕获;电流电压曲线随铅离子浓度从0.01-0.16μM和10-100μM逐渐增大,铅离子浓度与离子电流变化率有良好线性,方程式分别为|I-I0/I0|=9.1942x+0.093（R~2=0.9950）和|I-I0/I0|=0.0513x+1.4006（R~2=0.9918）,检出限为0.005μM。As2+,Cd3+,Co2+,Cr2+,Cu2+,Fe3+,Hg2+,Mg2+,Mn2+,Ni2+,Zn2+的信号响应较铅离子明显较低,证明传感器特异性良好。该肽链功能化的纳米通道生物传感器成功检测了四种中药饮片中的重金属铅含量,且与原子吸收分光光度法（AAS）相比,该肽链修饰的纳米通道生物传感器的回收率在87.7%-116.8%之间,证明该传感器可以用于监测中药实际样本中重金属铅含量。2.皮安计电流电压曲线、XPS、CA分析、FE-SEM、LSCM结果均证明新冠病毒S蛋白抗体成功修饰在通道表面,新冠病毒S蛋白成功被抗体捕获,SPR结果证明新冠病毒S蛋白抗体与新冠病毒S蛋白的亲和力良好,KD值为1.09 n M。MERS-Co V S、MERS-Co V N、H1N1、SARS N各蛋白的信号响应较新冠病毒S蛋白低,SAW和流式细胞仪结果发现新冠病毒S蛋白抗体较其他抗体对新冠病毒S蛋白响应更高,证明该传感器特异性好。在1×PBS中,电流电压曲线随铅离子浓度从1 fg/ml至1 ng/ml逐渐增大,新冠病毒S蛋白浓度与离子电流变化率有良好线性,方程式为Y=0.967lg C-2.6401（R~2=0.9960）,检出限为0.67 fg/ml。在咽拭子样本中,离子电流同样随着新冠病毒S蛋白浓度的增加而增加,响应范围为10 fg/ml至1 ng/ml,且该传感器对新冠假病毒响应较正常样本明显较高,证明该传感器对临床样本具有一定检测能力。3.本章成功制备ACE2高表达的293T细胞,分子对接结果发现5种中药活性成分与新冠病毒S蛋白结合能均小于-6 kcal/mol;进一步选取结合能最大的2种中药活性成分丹酚酸B和黄芩素作为检测对象进行荧光实验,荧光结果显示,与空白组相比,丹酚酸B及黄芩素组荧光强度明显降低;通过该传感器对丹酚酸B和黄芩素抑制情况进行考察,与空白组相比,丹酚酸B和黄芩素组电流变化率绝对值较高,证明该传感器可以用于监测中药活性成分抑制新冠病毒作用。结论1.本研究构建肽链修饰的氧化铝纳米通道生物传感器实现对铅离子免标记、高灵敏度检测,并成功应用到中药复杂样本的检测中。2.本研究构建抗体修饰的PET锥形纳米通道生物传感器实现对新冠病毒高灵敏、高特异性地检测,并成功应用于咽拭子样品的检测中。3.本研究通过建立的PET锥形纳米通道生物传感器成功监测中药活性成分抑制新冠假病毒作用,为中药抑制新冠病毒的研究提供了新思路。