中药为多组分的复杂体系,其疗效的发挥为多成分、多靶点、多途径协同作用的结果,单一或几个化学成分的定量检测难以全面评价其质量的优劣。中药指纹图谱因其具备宏观、整体和模糊的特点,能最大程度反映中药中所含化学成分的种类和含量,进而对中药质量进行整体的描述和评价,现已成为国内外广泛接受的一种中药质量控制模式。但目前中药指纹图谱技术所表征的只是其中化学成分群存在状态,并不能说明其与中药功效的相关性。因此,研究指纹图谱中化学成分的变化与药效的相关性,进而通过数理统计方法,找出与药理作用相关的药效物质群,即“谱效关系”研究,现已成为探索中药特定药效物质基础的主要技术手段。近年来,经过国内外学者的探索,谱效关系的研究模式日趋成熟,主要包括建立中药指纹图谱,并对指纹图谱中的成分进行分析;采用合适的药效评价模型,获取药效学数据;运用数据处理技术将指纹图谱数据和药效学数据进行关联、分析,结合中医药的专业知识,建立有实际意义的谱效关系。其中建立指纹图谱是关键,药效学评价是重点,而数理统计方法的运用是核心。本文拟从这三个方面对山楂叶提取物活血化瘀谱效关系进行研究。山楂叶为蔷薇科植物山里红（Crataegus pinnatifida Bge.Var.major N.E.Br.）或山楂（Crataegus pinnatifida Bge.）的干燥叶,具有活血化瘀、理气通脉、化浊降脂之功效。其主要活性成分为黄酮类化合物,如牡荆素鼠李糖苷、槲皮素、牡荆素、金丝桃苷等。目前,心血管疾病防治成为众多学者的研究热点,山楂叶因其资源丰富,成本低廉,多靶点的综合治疗作用及较低的毒副作用,正逐渐被开发利用制成不同制剂,如山玫胶囊和心安胶囊以山楂叶50%乙醇提取部位为原料,用于治疗冠心病,改善心肌供血量等病症;益心酮片以山楂叶乙酸乙酯部位（2010版中国药典）为原料,用于治疗淤血阻脉所致的胸痹,冠心病心绞痛等病症。本文选取了50%乙醇提取部位（A）、中国药典收录的山楂叶过大孔树脂后醇提取物（B）、乙酸乙酯提取部位（C）和水饱和正丁醇提取部位（D）进行活血化瘀谱效关系研究。目前,关于山楂叶活血化瘀的研究较多,主要集中在基因表达、抗氧化作用以及对心肌细胞线粒体功能影响等方面,尚未发现山楂叶提取物对血流变学以及全血黏度和血浆黏度等指标影响的研究。所以在课题组前期研究基础上,本文以山楂叶四种不同提取部位作为研究对象,在相同色谱条件上,建立HPLC指纹图谱;采用大鼠血瘀模型,低中高不同剂量灌胃给药,测定凝血四项,全血黏度,血浆黏度以及血常规等27个生化指标,采用主成分和单因素方差分析,筛选出与活血化瘀相关的生化指标;通过Matlab软件,采用逐步后退分析法建立各生化指标药效值Y与指纹图谱共有峰X的多元线性回归方程进行谱效关系研究,寻找山楂叶药效物质群,为进一步建立山楂叶与其活血化瘀疗效相关的内在质量标准提供依据。第一部分山楂叶四种提取物化学指纹图谱建立与总黄酮含量的比较目的:在相同取样量和同一色谱条件下,分别建立山楂叶四种不同提取部位,即50%乙醇提取部位（A）、中国药典收录的山楂叶过大孔树脂后醇提取物（B）、山楂叶乙酸乙酯部位（C）和山楂叶水饱和正丁醇部位（D）的HPLC指纹图谱,并且采用紫外分光光度法测定四种提取物的总黄酮含量,比较化学成分的异同及总黄酮含量的高低。方法:购买山楂叶提取物A和B各10批,收集山楂叶药材制备提取物C和D各10批。采用HPLC法,以乙腈（A）-0.1%冰醋酸（B）-四氢呋喃（C）为流动相,梯度洗脱（0⁵¹5³0⁵0⁶0⁷0⁸0¹20min）,A（10%¹2%¹2%¹2%¹2%²0%²0%³0%⁸0%）,B（90%⁸8%⁸8%⁸5%⁸5%⁷6%⁷3%⁶6%¹6%）,C（0%⁰%⁰%³%³%⁴%⁷%⁴%⁴%）,检测波长320nm,流速0.9ml/min,柱温30℃,进样量10μl。通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（国家药典委员会2004A）》分别建立山楂叶四种提取物指纹图谱,标定共有峰。按照《中国药典》2015年版山楂叶提取物项下的总黄酮含量测定方法,测定四种提取物的总黄酮含量,计算其平均值。结果:在相同取样量和同一色谱条件下,提取物A、B、C、D分别得到18个、18个、25个、20个共有峰,均含有6种已知成分,分别是绿原酸（S1）、牡荆素葡萄糖苷（S2）、牡荆素鼠李糖苷（S3）、牡荆素（S4）、芦丁（S5）、金丝桃苷（S6）。从A、B、C、D四个对照指纹图谱观察,乙酸乙酯部位C中,强极性、中等极性和弱极性部分均有共有峰分布且较均匀,峰面积大小适中,共有峰数目最多。与C部位相比,50%乙醇部位A的共有峰主要分布在强极性和中等极性部分,弱极性部分共有峰少且峰面积较小;大孔吸附树脂部位B的共有峰几乎全部集中在强极性和中等极性部分,且峰面积较大;饱和正丁醇部位D的共有峰分布与A部位相似。总黄酮含量测定结果,B总黄酮含量最高,平均值达到83.56%,C次之,平均值为58.61%;A和D的含量接近,平均值分别为33.81%和39.80%。结论:山楂叶四种提取物化学成分的种类和总黄酮含量存在明显差异,这种化学成分的不同,可能引起药理作用不同。本部分为进一步研究谱效关系提供了理论基础。第二部分山楂叶提取物活血化瘀作用的研究目的:将四种提取物各10批分别称取适量,均匀混合（为保证给药基质的均一性）,配成低、中、高3种剂量的试药,采用大鼠急性血瘀证模型,灌胃给药,测定27个生化指标,结合主成分和单因素方差分析,筛选出四种提取物中与活血化瘀作用相关的生化指标。方法:采用Wistar大鼠冰水浴肾上腺素急性血瘀证模型,分别灌胃给予低、中、高剂量的四种提取物（为保证试药基质的均一性,把四种提取物各10批均匀混合后,再分别制备3个剂量给药）,通过XN06-IV凝血仪测定凝血酶原时间（PT）、部分凝血酶原时间（APTT）、凝血酶时间（TT）、纤维蛋白原水平（FIB）,全血黏度检测仪测定全血黏度（低、中、高切变率共3个）,全自动清洗血流变仪测定血常规（白细胞总数、淋巴细胞百分比、红细胞总数等19个）,微量血浆测量仪测定血浆黏度,共27个指标。采用统计学软件SPSS19.0主成分分析法生成的互不相关主成分,结合各主成分的贡献率和各指标的相关系数,对各组别中的指标群及单个指标进行综合分析,将获得的新变量进行单因素方差分析,比较四种提取物对急性血瘀证大鼠各生化指标的影响,筛选出与活血化瘀作用相关的部分生化指标。结果:四种提取物活血化瘀试验检测的27个生化指标经过统计分析后,结果显示:（1）模型组与空白组相比,FIB、红细胞总数,血小板总数,血小板平均体积,血小板压积,全血黏度（低切变率,中切变率,高切变率）,血浆黏度均显著性升高（P<0.01）,结合生物学特征,结果显示血瘀模型大鼠造模成功。（2）与模型组相比,提取物A低中高剂量使血小板总数,血小板平均体积,血小板压积,低切变率,中切变率,高切变率,血浆黏度均能显著性降低（P<0.01）,并且具有剂量依赖性;与模型组相比,中,高剂量使FIB降低（P<0.05）,红细胞总数显著性降低（P<0.01）（3）与模型组相比,提取物B低中高剂量使红细胞总数、血小板总数,血小板平均体积,血小板压积,低切变率,中切变率,高切变率,血浆黏度指标均能显著性降低（P<0.01）,并且具有剂量依赖性;与模型组相比,高剂量使血红蛋白和FIB均能显著性降低（P<0.01）。（4）与模型组相比,提取物C低中高剂量使FIB,红细胞总数,血小板总数,血小板平均体积,血小板压积,低切变率,中切变率,高切变率,血浆黏度指标均能显著性降低（P<0.01）,并且具有剂量依赖性。（5）与模型组相比,提取物D低中高剂量使血小板总数,血小板平均体积,血小板压积,低切变率,中切变率,高切变率,血浆黏度均能显著性降低（P<0.01）;与模型组相比,高剂量使红细胞压积和红细胞总数降低（P<0.05）;与模型组相比,中,高剂量使FIB降低（P<0.05）。结论:四种提取物对筛选出的FIB,红细胞总数,血小板总数,血小板平均体积,血小板压积,低切变率,中切变率,高切变率,血浆黏度均有不同程度的影响,因此以上9个生化指标与活血化瘀具有相关性,可作为第三部分谱效关系研究中的“效”。第三部分山楂叶提取物活血化瘀谱效关系的研究目的:将混合后的四种提取物试药重新建立一个指纹图谱,标定共有峰峰面积为X,结合第二部分筛选出的生化指标Y,运用Matlab软件计算谱效关系方程,研究山楂叶提取物活血化瘀药效物质群。方法:采用HPLC法,参照第一部分的色谱条件,采集四种提取物低中高浓度共12份供试品溶液色谱图,通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（国家药典委员会2004A）》重新建立山楂叶四种提取物对照指纹图谱,标定共有峰,计算各峰面积。结合第二部分筛选出的生化指标,运用Matlab软件,采用逐步后退分析法建立各生化指标药效值Y与指纹图谱共有峰峰面积X的多元线性回归方程,获取山楂叶提取物活血化瘀药效物质群。结果:四种提取物重新建立的指纹图谱中,共标定32个共有峰。以各共有峰峰面积为自变量X,各提取物不同剂量与活血化瘀相关的9个生化指标数据为因变量Y,即FIB（Y1）、红细胞胞总数（Y2）,血小板总数（Y3）,血小板平均体积（Y4）,血小板压积（Y5）,低切变率（Y6）,中切变率（Y7）,高切变率（Y8）,血浆黏度（Y9）,应用Matlab软件,采用逐步后退回归方法,计算谱效关系方程如下:Y₁=3.684+32.919X₆-137.424X₉+5.917X₁₀+12.739X₁₃-21.789X₁₅-8.911X₁₇+55.929X₁₉+14.380X₂₁+40.266X₂₃-65.414X₂₇,r²=0.9999,P=0.0001<0.01Y₂=100.35+732.23X₁-2329.6X₅+43.44X₁₄+2433X₁₉+194.06X₂₁+885.61X₂₃+3617.6X₂₅+766.71X₂₆-13.119X₃₀-11672X₃₂,r²=0.9999,P=0.0002<0.01Y₃=155.241-38382X₁+5228.5X₈-11320X₁₅+23536X₁₈-41184X₁₉-17866X₂₃-54465X₂₇+74870X₂₈+48244X₃₁+733000X₃₂,r²=0.9999,P=0.0031<0.01Y₄=9.0806-262.25X₁+386.12X₈-158.30X₁₀-188.03X₁₁+3.2921X₁₂+69.553X₁₅-370.63X₁₉-96.547X₂₇+333.62X₃₁+4883X₃₂,r²=0.9999,P=0.0019<0.01Y₅=0.3323-7.3505X₁-46.676X₂-10.1838X₈-34.954X₉+13.7663X₁₀+23.7524X₁₁+21.272X₂₂-23.1355X₂₇-14.986X₂₉+797.285X₃₂,r²=0.9999,P=0.0027<0.01Y₆=7.9105-129.44X₃-594.09X₆+243.2993X₁₀-22.3509X₁₃+125.849X₁₉+62.4919X₂₁-59.7529X₂₃-584.1149X₂₇+141.7714X₃₁+11059X_32,r²=0.9999,P=0.0042<0.01Y₇=8.5820-6.1227X₃+60.0425X₉-21.4660X₁₀+0.5350X₁₄+33.8677X₁₅-36.8762X₁₉-5.7435X₂₁+30.2422X₂₃-45.0794X₂₈+593.8178X₃₂,r²=0.9999,P=0.0009<0.01Y₈=5.2432-25.7911X₄+48.0672X₅+37.3757X₁₀-19.1838X₁₃-0.3789X₁₅-70.3253X₁₉+43.1946X₂₂-91.9206X₂₃+8.7604X₃₀+892.2150X₃₂,r²=0.9999,P=0.0001<0.01Y₉=1.4767-4.5919X₉-1.9720X₁₀+3.5956X₁₁-0.5178X₁₃-0.7469X₁₄+1.7472X₁₅-0.4215X₁₇+1.5535X₁₉+6.8144X₂₇-13.8635X₃₁,r²=0.9999,P=0.0045<0.01其中,影响纤维蛋白原FIB的成分有X₁₉、X₂₃、X₆、X₂₁、X₁₃、X₁₀、X₁₇、X₁₅、X₂₇、X₉(X₁₇为牡荆素,X₁₉为芦丁);影响红细胞总数的成分有X₂₅、X₁₉、X₂₃、X₂₆、X₁、X₂₁、X₁₄、X₃₀、X₃₂、X₅(X₁₄为牡荆素葡萄糖苷,X₁₉为芦丁);影响血小板总数的成分有X₃₂、X₂₈、X₃₁、X₁₈、X₈、X₁₅、X₂₃、X₁、X₁₉、X₂₇(X₁₉为芦丁);影响血小板平均体积的成分有X₃₂、X₈、X₃₁、X₁₅、X₁₂、X₂₇、X₁₀、X₁₁、X₁、X₁₉(X₁₉为芦丁);影响血小板压积的成分有X₃₂、X₁₁、X₂₂、X₁₀、X₁、X₈、X₂₉、X₂₇、X₉、X₂;影响全血黏度低切变率的成分有X₃₂、X₁₀、X₃₁、X₁₉、X₂₁、X₁₃、X₂₃、X₃、X₂₇、X₆(X₃为绿原酸,X₁₉为芦丁);影响全血黏度中切变率的成分有X₃₂、X₉、X₁₅、X₂₃、X₁₄、X₂₁、X₃、X₁₀、X₁₉、X₂₈(X₃为绿原酸,X₁₄为牡荆素葡萄糖苷,X₁₉为芦丁);影响全血黏度高切变率的成分有X₃₂、X₅、X₂₂、X₁₀、X₃₀、X₁₅、X₁₃、X₄、X₁₉、X₂₃(X₁₉为芦丁);影响血浆黏度的成分有X₂₇、X₁₁、X₁₅、X₁₉、X₁₇、X₁₃、X₁₄、X₁₀、X₉、X₃₁(X₁₄为牡荆素葡萄糖苷,X₁₇为牡荆素,X₁₉为芦丁)。结论:本部分将混合后的四种提取物重新建立一个指纹图谱,共标定32个共有峰。以各共有峰峰面积为自变量X,各提取物不同剂量与活血化瘀相关的9个生化指标数据为因变量Y,通过Matlab软件的逐步后退法计算谱效关系方程,筛选出与活血化瘀作用相关的9个生化指标的活性物质群,为进一步建立山楂叶与其活血化瘀疗效相关的内在质量标准提供依据。