急性肺损伤(ALI)由非心源性的各种肺内、外致病因素引起的肺微血管和肺泡上皮细胞损伤为主要特征的肺部炎症综合征，是临床常见的危重症之一，发病率和死亡率较高。其病理特征表现为过度失控的炎症反应和细胞内Ca2+超载。炎症介质的产生又进一步增加的肺微血管弥漫性损害。NF-κB信号转导途径可能在ALI的病理过程中起着至关重要的作用。磷酸二酯酶4(PDE4)通过水解cAMP被认为是调节炎症反应的一个重要环节。研究表明，在动物模型和细胞模型中，PDE4抑制剂可以通过调节cAMP的活性减轻炎症反应。此外，cAMP作为重要的第二信使与细胞内Ca2+振荡有关。尽管对于ALI有大量的研究，但LPS诱导的ALI的潜在的分子机制仍然不清楚。在本研究的目的在于PDE4在LPS诱导的ALI中对NF-κB活性的调节和Ca2+振荡的调控。本研究主要内容包括：　　⑴抑制PDE4B抑制LPS诱导的NF-κB活化。用NF-κB-荧光素酶报告质粒瞬时转染多种细胞类型，分别观察Cilomilast和Diazepam对LPS诱导的NF-κB活性的影响。结果显示，Cilomilast和Diazepam抑制LPS诱导的肺上皮A549细胞NF-κB的激活和趋化活性，在肺血管内皮细胞PMVECs和血管平滑肌细胞中也表现出同样的抑制作用。为了进一步证实PDE4B直接参与调节NF-κB活性，我们将PMVECs的PDE4B基因敲减后检测NF-κB报告基因荧光素酶活性。结果显示，PMVECs在转染PDE4B siRNA后用2μg/mlLPS刺激24小时，产生了显著NF-κB活化下调。我们还研究了从C57BL/6野生型小鼠，PDE4B KD小鼠和shR-Ctrl小鼠中分离的PMVECs的NF-κB活化，PMVECs分别用2μg/ml LPS刺激24小时后，NF-κB活化显著降低。　　⑵PDE4抑制剂及PDE4B KD对PDE4活性的影响。测定Cilomilast和Diazepam对NF-κB活化的抑制作用是否是通过抑制PDE4介导的。我们研究了在PMVECs细胞中PDE4B蛋白表达和PDE4的活性。结果显示，Cilomilast和Diazepam明显降低PDE4活性，同时降低PDE4B蛋白表达。而且，PDE4B siRNA沉默PDE4B并显著降低PDE4的活性。从PDE4B KD小鼠中分离的PMVECs中PDE4B蛋白低表达和低PDE4活性我们得到了进一步的确认。　　⑶抑制PDE4B能够抑制LPS诱导的炎症介质释放。为了验证PDE4阻滞剂抑制LPS诱导NF-κB活化和上调炎症介质的表达，我们通过Western blot进行检测，结果发现，Cilomilast和Diazepam均能抑制LPS诱导的炎症介质的表达。同时，在PDE4B siRNA处理的PMVECs和或PDE4B敲减小鼠中分离的PMVECs中炎症介质的低表达也得到了进一步的证实。　　⑷沉默了PDE4B的PMVECs减低LPS造成的细胞内Ca2+水平升高。PDE4改变就意味着细胞内Ca+稳态的改变。因此我们接下来确定PDE4抑制剂对LPS诱导的炎症介质的抑制作用是否通过Ca+通道介导的。在Cilomilast和Diazepam、PDE4B siRNA预处理的PMVECs和PDE4B敲减小鼠中分离的PMVECs中，内毒素介导的Ca2+内流的Ca2+震荡都不同程度的下调。同时下调LPS诱导的IP3R-1蛋白表达。　　⑸阻断PDE4B抑制肺血管通透性。为了研究PDE4B对肺血管通透性的作用，我们在细胞和动物中分别建立ALI的实验模型。我们证实了在体外和体内由LPS刺激能够引起膜的渗透性显著增加。我们还发现，在Cilomilast和Diazepam、PDE4B siRNA预处理的PMVECs和PDE4B敲除小鼠中分离的PMVECs中，LPS诱导的ICAM-1和VCAM-1的表达量明显减低。同时，也降低了单核细胞对PMVECs的粘附性。我们进一步研究了阻断PDE4B是否会影响内皮细胞的迁移。结果显示，LPS诱导的内皮细胞迁移在Cilomilast和Diazepam、PDE4B siRNA组或PDE4B减小鼠组的PMVECs组减弱。为了进一步指出氧化应激在参与ALI病理过程的潜在机制，我们研究了PDE4B KD小鼠ROS的活化。结果发现，细胞内ROS的量是下降的。　　⑹阻断PDE4B抑制肺部炎症反应。为了确定PDE4B调控炎症的生理意义，我们通过在体LPS诱导ALI模型进行观察。在PDE4B KD小鼠或PDE4B抑制剂预处理的小鼠中PDE4B的表达减低。我们HE染色病理切片评估PDE4B抑制剂剂PDE4B shRNA慢病毒颗粒对LPS诱导炎症的作用，结果显示，小鼠在气道内给予100μg/kgLPS6h后产生ALI，肺泡结构破坏，相比之下，在PDE4B抑制剂组和PDE4B shRNA慢病毒颗粒转染组，小鼠肺结构破坏和白细胞浸润的现象明显的缓解。而且，抑制PDE4B的小鼠BALF中性粒细胞数量减低。小鼠BALF上清液中IL-8，TNF-α和MCP-1的水平在PDE4B抑制剂组和PDE4B shRNA慢病毒颗粒转染组低于单纯LPS刺激组。代表肺水含量的肺湿/干比值在PDE4B抑制剂组和PDE4B shRNA慢病毒颗粒转染组也较单纯LPS刺激组下降。在单纯LPS刺激组氧合指数(P/F)显著下降，说明ALI模型成功，在Cilomilast和Diazepam预处理后小鼠和PDE4BshRNA慢病毒颗粒转染组小鼠中LPS刺激氧合指数也有所下降，但不如单纯LPS刺激组明显。我们还检测了ICAM-1和VACM-1的蛋白表达，发现ICAM-1和VACM-1在PDE4B KD小鼠和PDE4B抑制剂治疗的小鼠中表达显著降低。　　⑺研究表明：①PDE4抑制剂抑制LPS诱导肺实质细胞NF-κB转录活性增强；②PDE4抑制剂抑制PDE4B蛋白表达和PDE4活性；③抑制PDE4B能够抑制LPS诱发的炎症介质表达，包括MCP-1、IL-8、ICAM-1和VCAM-1；④PDE4抑制剂能够降低PMVECs细胞内Ca2+水平和IP3R-1表达；⑤抑制PDE4B限制肺血管通透性、细胞内ROS产生；⑥PDE4抑制剂和PDE4B shRNA减轻小鼠急性肺损伤的肺部炎症反应。