皮肤黑素瘤是一种高恶性、发展快、易转移、预后差的恶性肿瘤,然而,目前还缺少能确定黑素瘤是否具有高侵袭性的特异性标志。Wnt信号通路是近年来备受关注的一条调控胚胎发育和肿瘤形成的信号转导途径,目前认为,Wnt信号通路包括经典Wnt/β-catenin途径和非经的Wnt/Ca2+途径及Wnt/JNK途径,已有的文献资料及我们的前期研究结果显示,经典Wnt/β-catenin通路在恶性黑素瘤中被激活,可能在黑素瘤的发生过程中具有重要作用。但是目前对于非经典Wnt/Ca2+通路在黑素瘤发生和发展过程中的激活状态的动态变化及其功能意义并不明确。因此,本课题以来自不同生长阶段的六种黑素瘤细胞系为标本,采用RT-PCR法检测Wnt/Ca2+信号途径激活的关键配体Wnt5a和Wnt11的基因表达水平;运用钙离子成像的方法,结合药理学实验,检测卡巴胆碱对上述细胞钙离子稳态的影响及蛋白激酶C的调节作用,进一步揭示该信号途径在黑素瘤发展过程中的功能意义。第一部分正常黑素细胞和六种黑素瘤细胞的形态特征及侵袭能力比较细胞形态学显示:培养的正常黑素细胞和黑素瘤细胞在生长方式和细胞形态上均有显著的不同。培养的表皮黑素细胞呈现规则的涡旋状生长方式,细胞形态为纤细的双极纺锤状,细胞核清晰,黑素颗粒少见。浅表扩散型恶性黑素瘤(primary superficial spreading situation)(WM793B细胞株)形态多为双极纺锤状,黑素颗粒较多;结节性恶性黑素瘤(nodular melanoma situation) (451Lu细胞株)形态为树枝状;来自黑素瘤腋窝淋巴结转移的SK-MEL-5细胞株形态为短纺锤状,并有局部聚集生长的倾向;来自黑素瘤淋巴结转移(lymph node metastases)、具有高侵袭特性的A2058细胞呈局部聚集生长,形态主要为纺锤状;Libr细胞和A-375细胞也呈现纺锤状。划痕试验结果显示:来自黑素瘤淋巴结转移阶段的A2058细胞和SK-MEL-5细胞具有较强的侵袭能力,可以在12小时和24小时侵入划痕区域;结节性恶性黑素瘤451Lu细胞在48小时开始侵入划痕区域,而浅表扩散型恶性黑素瘤WM793B细胞在48小时内未见明显的变化。结果提示:与正常的黑素细胞相比,六种黑素瘤细胞均呈现出典型的肿瘤细胞特性,即细胞膜、细胞核的形态异质性以及生长方式的不规则性,并且随着黑素瘤由浅表扩散至淋巴结转移的不同发展阶段,肿瘤细胞的侵袭能力逐渐增强。第二部分不同生长阶段黑素瘤中Wnt5A和Wnt11基因表达的动态变化及其意义运用RT-PCR法,检测正常黑素细胞和六种来自不同生长阶段的皮肤黑素瘤细胞(包括WM793B、451Lu、SK-MEL-5、A2058、Libr和A-375)中Wnt5A和Wnt11基因表达水平。结果表明:在正常黑素细胞和不同的黑素瘤细胞中,Wnt5A和Wnt11基因的表达均表现出动态变化的特征,并且二者的变化是一致的。Wnt5A和Wnt11水平在正常黑素细胞中表达很低,而在黑素瘤有不同程度的升高。另外,分别来自于浅表扩散型恶性黑素瘤、结节性恶性黑素瘤和淋巴结转移阶段的WM793B、451Lu和A2058细胞系中,Wnt5A和Wnt11基因表达水平逐渐下降,甚至在A2058细胞系中,两种基因的表达均低于正常黑素细胞。结果提示:在黑素瘤的不同发展阶段,Wnt5A和Wnt11基因表达的动态变化使非经典的Wnt/Ca2+通路激活程度不同,从而影响肿瘤的侵袭能力。第三部分卡巴胆碱对不同生长阶段的黑素瘤细胞中钙离子稳态的影响及蛋白激酶C的调节作用钙离子成像的结果显示:正常黑素细胞对卡巴胆碱(1 mM)无明显反应,而WM793B、451Lu、SK-MEL-5、A2058、Libr和A-375细胞对卡巴胆碱(1 mM)诱发的细胞内钙离子浓度变化反应均有不同程度的升高,其中以来自淋巴结转移的A2058细胞最为显著。提前给予蛋白激酶C的激动剂phorbol 12, 13-dibutyrate (PDBu, 2μM)对上述卡巴胆碱诱发的胞内钙离子浓度变化具有不同的抑制作用。结果提示:在黑素瘤发展过程中,介导卡巴胆碱诱发钙离子稳态变化的毒蕈碱样胆碱能受体在表型或功能上是动态变化的,蛋白激酶C参与该受体功能的调节。在来自淋巴结转移阶段的A2058细胞系中,Wnt5A和Wnt11基因表达很低,卡巴胆碱诱发的细胞钙离子稳态的反应却显著高于其他检测细胞,该结果提示:Wnt/Ca2+信号通路的下游信号分子——细胞内蛋白激酶C的激活可以抑制卡巴胆碱诱发的钙离子稳态的变化,进一步证实了蛋白激酶C的负性调节作用。结论:1.实验所用WM793B、451Lu、SK-MEL-5、A2058、Libr和A-375黑素瘤细胞分别来自肿瘤的不同发展阶段。形态学试验和侵袭能力检测结果提示:六种黑素瘤细胞均呈现出典型的肿瘤细胞特性,即细胞膜、细胞核的形态异质性以及生长方式的不规则性,并且随着黑素瘤由浅表扩散至淋巴结转移的不同发展阶段,肿瘤细胞的侵袭能力逐渐增强。运用这些肿瘤细胞株可以模拟黑素瘤动态发展的过程。2.在黑素瘤的不同发展过程中,Wnt5A和Wnt11基因的表达均表现出动态变化的特征,并且二者的变化是一致的。分别来自于浅表扩散型恶性黑素瘤、结节性恶性黑素瘤和淋巴结转移阶段的WM793B、451Lu和A2058细胞系中,Wnt5A和Wnt11基因表达水平有逐渐下降的趋势,甚至在A2058细胞系中,两种基因的表达均低于正常黑素细胞。结果提示:在黑素瘤的不同发展阶段,Wnt5A和Wnt11基因表达的动态变化使非经典的Wnt/Ca2+通路激活程度不同,从而影响肿瘤的侵袭能力。3.与正常黑素细胞相比,卡巴胆碱对不同生长阶段的黑素瘤中钙离子稳态的影响显著增强,但是程度不同,尤其对A2058细胞作用最为明显。蛋白激酶C激动剂可以抑制上述反应,提示介导卡巴胆碱诱发钙离子稳态变化的毒蕈碱样胆碱能受体可以被PKC负性调节。另外,在来自淋巴结转移阶段的A2058细胞系中,Wnt5A和Wnt11基因表达很低,卡巴胆碱诱发的钙离子稳态的变化却显著高于其他检测细胞,提示Wnt/Ca2+信号通路的下游信号分子——蛋白激酶C可能调节毒蕈碱样胆碱能受体的功能。