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转基因动物突变研究模型的建立使DNA损伤的诱发和修复、突变和癌变的研究得以在一个整体动物内进行，也提供了一个快速检测组织特异性突变的有效的四维系统。目前注册商标为BigBlueTM、MutaTM Mouse 和Xenomouse的小鼠已进入商业渠道。在前两种小鼠中由于是根据(噬菌体体外包装原理来进行的，在载体回收时受到体外包装分子大小的限制，而Xenomouse小鼠品系虽克服了上述缺陷，但它是以较长的Lac Z基因（3,087 bp）作为突变靶基因，因此测序工作量较大，而且在突变子的蓝白班筛选中也易产生误差[35，36，37]。 本课题组长期致力于转基因动物体内突变检测系统的研究。本研究报道了能同时检测体内表达基因和沉默基因突变状况的基于质粒pMCLacI/neo的转基因小鼠品系。该质粒因含有两个Lac I突变靶基因，其中一个表达，另一个不表达，而有别于国内外已建立的突变检测系统，能更全面地反映体内的生理状况。该系统可应用于对化学物质的遗传毒性的体内监测、肿瘤发生发展的分子机制的探讨、药物的安全性评价等研究,具有较广泛的应用前景[38，39，40]。由于pMCLacI/neo转基因小鼠含有两种不同状态的LacI靶基因，有别于以往所建立的只含有一种靶基因的系统。因此，建立一种能快速、有效地分析这两种靶基因的检测方法，成为该转基因小鼠建立后的又一新课题。通过适当方法将pMCLacI/neo中两种LacI靶基因分开后，采用了新近建立的M9/L正向选择系统进行检测，并用已知的LacI基因突变子作为阳性对照，验证该策略的可行性。实验结果提示, M9/L正向选择系统可应用于pMCLacI/neo转基因小鼠中两种LacI靶基因的检测；实验中所建立的突变检测方法快速、有效。在前期建立的基于pMCLacI/neo载体的转基因小鼠品系，我们又展开了MNNG对该转基因小鼠的不同组织细胞内的LacI靶基因的诱变率和诱变谱研究。结果提示从突变发生的区域来看，在25个突变子中，13个发生在靠近羧基端至LacO基因区域，是突变发生的热点。同时有7个突变子发生在LacI基因的编码区的氨基端区域中，也是突变发生的热点。从突变发生的靶基因的表达情况来看，24%（6/25）的突变发生在表达的靶基因区域，76％（19/25）的突变发生在沉默状态的靶基因区域.从突变发生的位点来看，大部分的突变都发生在CpG岛，这再次<WP=8>表明在真核生物基因组DNA内CpG岛是突变的主要发生位点。由于本研究率先在突变检测系统中应用了具有双功能的pMCLacI/neo穿梭载体,在利用转基因动物技术建立突变检测系统及展开相关研究的同时，我们又利用基因敲除技术，定向敲除DNA损伤修复酶基因-MGMT，建立了一系列MGMT基因定向敲除的突变检测系统，及高表达MGMT的突变检测系统，并展开了相应的DNA损伤修复的研究。O6－甲基鸟嘌呤－DNA甲基转移酶（O6－methylguanine－DNA methyltransferase,MGMT）能促进甲基从甲基化的DNA（ O6－甲基鸟嘌呤和O4－甲基胸腺嘧啶）的去除，因此一步反应就修复了突变基因的损伤 。利用基因打靶技术与穿梭载体技术，我们建立了小鼠成纤维细胞（NIH3T3） 甲基转移酶缺陷的并同时具有突变检测功能的细胞系。PCR和Southern结果揭示MGMT 基因的Exon2 及Exon5分别被敲除，同时通过RT-PCR，我们又成功构建了MGMT的表达载体。MNNG （N－Methyl－N’－Nitro－N－Nitrosoguanidine）诱变实验证实，MGMT-/-细胞对烷化剂呈现高度敏感性，然而，高表达MGMT的细胞相对较不敏感。当暴露在相对较低剂量的MNNG时，MGMT-/-细胞呈现高突变。细胞电镜和流式细胞仪分析，揭示出经MNNG处理的MGMT-/-细胞发生了程序性死亡细胞，细胞增殖阻断在G2－M期[45，46，47]。NIH3T3细胞MGMT基因的定向敲除及其突变检测系统的建立，将有助于MGMT问题的研究。同时，由于某些烷化剂又是肿瘤治疗中的一大类化疗药物，MGMT水平的高低不但是衡量药物抗性的分子基础，而且可能成为预见性判断某些抗肿瘤药物疗效的重要指标。因此，对MGMT问题的进一步探讨，不但具有基础研究的意义，更重要的是具有临床应用的潜在价值。