【摘 要】
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近年来,转录调控因子被广泛应用于真菌次级代谢产物挖掘研究中,其中具有表观修饰功能的全局调控因子是目前研究的热点。该类型的代表Lae A基因已经成功在多个真菌中实现遗传操作,并挖掘出部分新小分子化合物,也使一些常见化合物例如青霉素、洛伐他丁、杂色曲霉素等的产量增多。因此发现更多类似的全局调控因子,不仅有助于我们更好地去理解真菌次级代谢网络的一个宏观调控过程,也对真菌次级代谢产物的深度挖掘打下结实的分
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近年来,转录调控因子被广泛应用于真菌次级代谢产物挖掘研究中,其中具有表观修饰功能的全局调控因子是目前研究的热点。该类型的代表Lae A基因已经成功在多个真菌中实现遗传操作,并挖掘出部分新小分子化合物,也使一些常见化合物例如青霉素、洛伐他丁、杂色曲霉素等的产量增多。因此发现更多类似的全局调控因子,不仅有助于我们更好地去理解真菌次级代谢网络的一个宏观调控过程,也对真菌次级代谢产物的深度挖掘打下结实的分子理论基础。本文以毛韧革菌(Stereum hirsutum)为主要研究对象,从其基因组信息中筛选出一个可能具有转录调控功能的基因,将其命名为Sara C。经过对其蛋白序列和保守结构域的分析,我们发现该基因具有甲基转移功能的锌指结构,并且该基因与其他基因的同源性非常低,进一步根据保守序列所对应的基因家族和该基因进行聚类分析,发现Sara C单独聚类,具有一定的种属特异性。由于韧革菌属遗传操作较为困难,可借鉴的方法较少,在多方面考虑下,我们选择了农杆菌介导的遗传操作体系,构建了两个过表达菌株,对其菌落形态、生长速率、抗逆性抑制率进行评估,并利用甲基化组、转录组和代谢组三组学联用分析Sara C基因的功能。此外,我们构建了Sara C蛋白异源表达体系,以及基于LC-MS检测的体外活酶检测体系。主要结果如下:(1)获得两个可验证的转化子SA4和SA6,经PCR验证并测序后,结果显示SA4和SA6均被插入了带有强启动子的Sara C基因,RT-q PCR结果发现,与野生型对比,过表达转化子SA4和SA6中的Sara C基因转录水平明显上调,其中SA4和SA6培养15 d的时候,Sara C基因转录水平上调了近3倍水平。(2)对其菌落形态和生长速率进行评估时,发现SA4色素产量明显增多,并且5 d后的生长速率略快于野生型,而SA6色素产量低生长速率最慢。(3)SA4和SA6过表达菌株对细胞壁合成干扰剂SDS非常敏感,而对刚果红耐受性较好,而在添加了高渗试剂山梨醇和氯化钠上的TG平板上生长较于野生型来说更为良好,并且色素产量明显增多;在含0.75 M山梨醇的TG平板上,SA4和SA6菌落也出现色素产量明显增多的现象。因此Sara C基因可能参与真菌高渗环境和氧化胁迫下的色素合成,但在细胞壁的合成上Sara C基因可能是起负作用。(4)甲基化组的数据揭示,两个过表达菌株SA4和SA6在Cp G、CHH、CHG、6m A四个位点上超低甲基化水平的数量较高,并且对其进行GO/KEGG富集分析后发现Cp G和6m A位点上的甲基化与转录调控基因的关联性非常高。转录组数据显示,SA6在10天时有许多转录调控相关基因表达量上调2倍以上,并且关于次生代谢生物合成的基因也有许多,对这些基因在毛韧革菌SM基因簇中进行定位发现,有6个基因簇的核心基因表达量上调1.5倍以上,有的甚至高达3倍以上。而代谢组学进一步验证了转录组和甲基化组的数据,SA6产生了较多的显著差异化合物,并且这些化合物在野生型中几乎不产生或者产量极低。根据以上结果,我们推测Sara C基因是一个具有DNA去甲基化功能的转录调控因子。(5)体外酶活实验数据显示,对照组中(含底物)能检测到带甲基化的底物峰,检测不到去甲基的产物峰;在纯酶处理组中,既能检测到带甲基的底物峰也能检测到去甲基的产物峰,因此说明Sara C蛋白可在DNA双链上去甲基化。
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