糙皮侧耳漆酶转录因子基因ltf4的克隆及功能分析

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糙皮侧耳作为一种大型木腐真菌,通过分泌漆酶来降解培养料中的木质素。在糙皮侧耳基因组中共有12条假定的漆酶编码基因,其中,poxc(lacc10)基因的编码产物是一种典型的糙皮侧耳漆酶,并且其表达量在糙皮侧耳整个生长发育过程中均很高。ltf4是通过应用酵母单杂交技术,利用糙皮侧耳poxc核心启动子序列构建诱饵菌株,从子实体cDNA文库中得到的基因。  本文以糙皮侧耳新831菌株作为研究对象,对ltf4基因进行了如下研究:扩增ltf4基因的CDS区并对其进行生物信息学分析;利用反转录PCR(RT-PCR)对ltf4和poxc基因进行表达模式分析;对ltf4基因进行原核异源表达及蛋白纯化;利用凝胶阻滞实验(EMSA)检测LTF4与poxc核心启动子序列的互作情况;构建ltf4基因的过表达和反义沉默载体,为ltf4基因功能的体内分析做准备。本文主要结论如下:  1、以糙皮侧耳子实体期cDNA为模板进行PCR,成功克隆得到了糙皮侧耳ltf4基因的CDS区,ltf4基因CDS区长1,608bp,编码产物长535aa。生物信息学分析结果显示:LTF4与糙皮侧耳PC15中某假定蛋白(KDQ29010.1)的氨基酸序列具有97.53%的一致性,同属于MocR家族,具有典型的HTH型DNA结合结构域。  2、构建了原核表达载体pEASY-E2-ltf4,并对其进行了诱导表达和蛋白纯化。SDS-PAGE结果显示:LTF4的分子量约为60kDa,与预期相符。  3、以糙皮侧耳β-actin作为内参基因,通过RT-PCR对糙皮侧耳poxc和ltf4基因在双核菌丝期、菌丝扭结期、原基期、桑葚期、珊瑚期及子实体成熟期的表达模式进行了分析,结果显示:poxc和ltf4基因均在糙皮侧耳菌丝扭结期表达量较大。  4、通过EMSA实验对LTF4与poxc基因的核心启动子区的互作进行了检测分析。实验结果显示:LTF4能够与poxc基因的核心启动子区结合。  5、通过对真核表达载体pPo-GPD及ltf4基因进行酶切、酶连,成功构建了糙皮侧耳ltf4基因的过表达载体pPo-GPD-ltf4+和反义沉默表达载体pPo-GPD-ltf4-,并将其转入了根癌农杆菌EHA105中,拟通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法转化糙皮侧耳,为后续体内验证ltf4基因的功能奠定基础。
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