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包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）和克罗恩病（Crohn’s disease,CD）在内的炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）是一种慢性自身免疫性疾病,不仅会影响患者的身体健康,还会对患者的生活质量产生一定的负面影响。越来越多的实验证据支持免疫紊乱在IBD的发病机制中扮演着重要的角色。最近,研究人员发现肠道蠕虫在调节宿主免疫应答方面具有巨大的潜力,因此,肠道蠕虫可能对机体内由过度的免疫应答所诱导的炎症反应具有潜在的治疗作用。尽管蠕虫可能对治疗IBD有益,但治疗性蠕虫感染仍存在潜在的副作用。因此,鉴定源自蠕虫的具有抗结肠炎作用的免疫调节分子,对于开发治疗IBD的新方法来说至关重要。在调控炎症反应的过程中,蛋白酶和蛋白酶抑制剂通常发挥着重要的作用。因此,我们推测蠕虫来源的蛋白酶及蛋白酶抑制剂可能会通过一系列机制而参与调控免疫异常相关的炎症反应。本实验选取重组的旋毛虫（Trichinella spiralis,T.spiralis）丝氨酸蛋白酶抑制剂（Serine protease inhibition,SPI）（Ts Ka SPI和Ts Ad SPI）作为研究对象,进一步分析其对2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-Trinitrobenzenesulfonic acid solution,TNBS）诱导的小鼠实验性结肠炎的干预效应及潜在的免疫学机制,从而为开发新的有效的治疗IBD的蠕虫衍生蛋白/药物奠定一定的研究基础。本研究的具体内容分为以下四个部分:（1）Ts Ka SPI和Ts Ad SPI对小鼠结肠炎的干预效应BALB/c小鼠被随机分为两大组,分别为预防组和治疗组。检测结肠炎的各项指标变化,从而验证Ts Ka SPI和Ts Ad SPI作为T.spiralis排泄/分泌（ES）抗原的主要成分是否可以减轻TNBS诱导的结肠炎的炎症严重程度。首先我们每天记录小鼠体重变化并计算疾病活动指数（DAI）评分。结果表明,PBS+TNBS组和TNBS+PBS组小鼠体重持续下降,DAI评分持续增加,且均在第7天达到峰值。随后处死小鼠,并通过观察结肠组织眼观病理变化和组织学病理变化,从而进一步分析重组蛋白对肠道炎症所产生的影响。结果表明,无论是在建立结肠炎模型之前还是之后免疫Ts Ka SPI和Ts Ad SPI均可以减轻肠组织的眼观病理损伤和组织学病理损伤程度,从而对肠道炎症产生一定的缓解作用。作为中性粒细胞活化的标志物,MPO参与许多过程的调节,其中最重要的为炎症反应。因此,本实验同样对结肠组织中MPO的表达水平进行了检测。ELISA检测结果表明,与PBS+TNBS组相比,Ts Ka SPI+TNBS组和Ts Ad SPI+TNBS组的MPO活性显著降低,说明肠道炎症反应受到了一定程度的抑制。将治疗组中的各小组进行比较,我们也观察到了相似的差异性。通过对上述指标进行检测,我们初步认为Ts Ka SPI和Ts Ad SPI对小鼠结肠炎具有一定程度的预防及治疗作用。（2）T、B细胞在重组蛋白发挥干预效应的过程中的变化研究表明,在炎症反应的过程中通常伴随着Th1和Th17型免疫反应,而感染T.spiralis后,宿主体内则会出现Th1/Th2混合型免疫反应,并且Th2型占据主导地位。同时,研究人员发现在机体发生危害严重的炎症反应的过程中通常伴随着不充分的Treg型免疫反应,且在T.spiralis感染的肌肉组织中也可以发现Treg细胞的浸润。因此,本实验通过检测肠系膜淋巴结（Mesenteric lymph node,MLN）和脾脏淋巴细胞单细胞悬液中CD4+IFN-γ+Th1、CD4+IL-4+Th2、CD4+IL-17A+Th17和CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的数量的变化而进一步分析辅助性T细胞是否为重组蛋白对结肠炎发挥干预效应的潜在靶标。流式细胞术（FCM）检测结果显示,与PBS+TNBS组相比,Ts Ka SPI+TNBS组和Ts Ad SPI+TNBS组中CD4+IFN-γ+Th1、CD4+IL-17A+Th17和CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞占CD4+T细胞的百分比明显增加,而CD4+IL-4+Th2细胞的百分比则明显减少。治疗组的各小组也呈现出同样的变化趋势。同时,细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-17在结肠组织中的表达量也通过ELISA试剂盒进行检测,结果与预期相一致。因此,我们初步认为重组蛋白可以通过调控辅助性T细胞应答,增加抗炎性细胞因子的表达量,减少促炎性细胞因子的表达量而对小鼠的结肠炎产生一定的缓解作用。同时,我们还检测了发挥免疫抑制作用的CD8+CD28-T细胞和CD19+CD5+CD1dhi Breg细胞的表达水平的变化,结果表明在结肠炎小鼠体内上述两种细胞的表达水平明显降低,且免疫重组蛋白可以通过诱导上述两种细胞的增殖而对机体内过度的免疫应答产生抑制作用,从而缓解肠道炎症症状。（3）树突状细胞在重组蛋白发挥干预效应的过程中的变化最近,研究人员发现树突状细胞（Dendritic Cell,DC）参与IBD的疾病进程,并扮演着重要的角色。在IBD患者的疾病活动期,可检测到活化的DCs的数量显著增加,从而导致机体免疫功能发生紊乱,并引发强烈的抗自身免疫性反应。而T.spiralis则可以通过诱导DCs发育为不完全成熟的表型从而抑制宿主针对其感染产生的免疫应答的强度。因此,本实验检测了从MLN和脾脏中提取的DCs的成熟度的变化情况。结果表明,DCs表面标记（如CD40、CD80、CD86、MHC-II）在TNBS诱导下均呈现出较高的表达水平,而免疫重组蛋白则导致小鼠体内DCs表面标记分子处于低表达的状态,因此,我们推测重组蛋白可以通过限制DCs的成熟度而对机体内过度的免疫反应产生一定的抑制作用,从而缓解结肠炎炎症的严重程度。同样的,Toll样受体（Toll-like receptor,TLR）依赖性信号通路在炎症反应中也起着至关重要的作用,因此我们通过q PCR对小鼠结肠组织中TLR4信号通路中关键因子的m RNA转录水平进行了检测。结果表明,重组蛋白可以通过降低TLR4信号通路中TLR4、My D88、IRAK、TRAF6、TRAM、TRIF和NF-κB的表达水平,从而抑制结肠炎小鼠体内TLR4信号通路的过度活化,进而抑制过度的免疫应答并发挥缓解肠道炎症的作用。同时,我们使用Western Blotting对NF-κB的活化通路进行了检测,结果表明免疫重组蛋白可以通过降低IKB-α的磷酸化水平而限制NF-κB的过表达。此外,在治疗组中,我们发现了相似的结果。因此,我们初步认为Ts Ka SPI和Ts Ad SPI可以通过调控DCs的成熟度及TLR4/NF-κB信号通路的活化来缓解TNBS诱导的结肠炎。（4）巨噬细胞在重组蛋白发挥干预效应的过程中的变化众所周知,巨噬细胞可以通过释放促炎性细胞因子而参与肠道炎症反应的发生与发展,且已有研究发现,在IBD患者的外周血和炎症部位,M1表型巨噬细胞异常活化。而蠕虫感染则会显著地增加宿主体内M2表型巨噬细胞的活化。因此,我们通过检测MLN和脾脏淋巴细胞单细胞悬液中M1、M2表型巨噬细胞的表达水平的变化从而分析巨噬细胞是否为重组蛋白对结肠炎发挥干预作用的潜在靶标。FCM检测结果表明,TNBS诱导导致MLN和脾脏淋巴细胞单细胞悬液中M1表型巨噬细胞显著增加,而免疫重组蛋白则使M2表型巨噬细胞显著增加。同时,i NOS和Arg1分别为M1和M2表型巨噬细胞的识别标志,因此,通过ELISA对结肠组织中i NOS和Arg1的表达量也进行了检测,结果与预期相符。所以,我们认为重组蛋白可以通过诱导M2表型巨噬细胞的增殖分化,从而降低TGF-β等促炎性细胞因子的表达量,并增加IL-23等抗炎性细胞因子的表达量,最终对肠道炎症症状起到一定的缓解作用。Janus激酶/信号转导子和转录激活子（JAK/STAT）信号通路参与激活多种至关重要的细胞过程,因此本实验对IL-6/JAK2/STAT3信号通路中关键因子的磷酸化水平进行了检测,Western Blotting结果表明,重组蛋白可以通过增加该信号通路中相关蛋白的磷酸化水平而对机体内过度的免疫反应产生一定的抑制作用,从而缓解TNBS诱导的结肠炎。综上所述,本实验已证实Ts Ka SPI和Ts Ad SPI对TNBS诱导的小鼠实验性结肠炎具有预防性及治疗性作用,且许多免疫细胞均可以成为Ts Ka SPI和Ts Ad SPI干预结肠炎的潜在靶标。因此,本实验结果可以为开发新的有效的蠕虫衍生药物提供一定的理论依据。