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2010年5月美国FDA第一次以肿瘤抗原负载DC(dendritic cell树突状细胞)疫苗的方式通过了过继免疫治疗应用于前列腺癌的治疗方案,这种全新的治疗形式使全世界的肿瘤研究及临床治疗进入了一个新时期.目前DC-CIK(dendritic cells-cytokine induced killer cell树突状细胞-细胞因子诱导的杀伤细胞)联合放化疗治疗多种恶性肿瘤,对抑制肿瘤进展和转移,降低肿瘤负荷,提高患者生活质量,延长患者生存时间都有一定的意义.
DC是目前被广泛认可的抗原递呈功能最强的专职抗原递呈细胞(antigen presenting cell,APC),成熟DC具有很强的诱导初始T细胞活化,激活免疫应答的功能,是固有免疫中巨噬细胞和适应性免疫中B细胞功能的100~1000倍.但目前临床应用的DC其成熟度与疗效所需的成熟度仍有差距,这也许是DC-CIK细胞免疫治疗已大量应用于肿瘤治疗中,并得到一定的认可,但疗效仍有限的原因之一.
自1996年JulesA.Hoffmann等报告了Toll样受体(Toll-like receptor TLR)在果蝇成虫真菌感染激起的固有免疫应答过程中发挥不可或缺的作用,国内外开始大量研究TLR的配体刺激DC成熟的方案,并得到广泛证实.TLR3特异性高表达于DC细胞,poly(I：C)(polyinosinic-polycytidylic acid聚肌胞苷酸,聚肌苷酸-聚胞苷酸)是TLR3的配体,DC细胞膜上的TLR3可识别并结合poly(I：C),介导非依赖MyD88性途径,起始信号通路,诱导产生I型IFN,并通过IFN-α/β所介导的信号途径促进DC成熟.本课题主要研究poly(I：C)较传统刺激DC成熟物质TNF-α(Tumor necrosis factor-α肿瘤坏死因子α)对影响DC成熟度是否不同,及DC的成熟度不同对初始T淋巴细胞的活化程度是否有影响,最后应用于患者,探讨对患者体内免疫功能是否有更好的作用.
第一部分：Poly(I：C)刺激DC的成熟及鉴定
目的：明确poly(I：C)是否可以提高DC成熟度.
方法：血细胞分离机分离患者外周血PBMC(外周血单个核细胞peripheral blood mononuclear cell),体外培养,以贴壁法获取DC,第0天和第4天用GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor粒细胞巨噬细胞刺激因子)、IL-4(Interleukin4白介素4)刺激DC分化,第6天加入腺病毒负载多抗原,第7天实验组加入poly(I：C)+IFN-γ,对照组加入TNF-α,第8天收获DC并检测其成熟度.
结果：连续第7、8、9天检测胞外IL-12分泌水平,发现在第8天分泌量最高,同时实验组分泌量显著高于对照组;结合ELISA结果,第8天检测DC表面表型的表达,同样发现实验组CD80和HLA-DR表达较对照组明显升高,有统计学差异;CD83和CD86表达也较对照组有所升高.
结论：Poly(I：C)可有效刺激DC成熟,并高表达CD80、CD83、CD86和HLA-DR,同时大量分泌IL-12.
第二部分：不同成熟度的DC对T细胞的活化程度的影响、及其活性分析
目的：探讨不同成熟度DC,对诱导初始T淋巴细胞活化程度的影响.
方法：第8天按细胞数初始T淋巴细胞：DC=20：1,计算相同细胞数,将实验组和对照组DC与初始T淋巴细胞共培养,同时加入一定比例IL-2一同刺激T细胞活化,第10天加入相同数量DC及同比例IL-2,共培养过程中光镜观察T细胞形态变化,第12天收获T细胞并检测其活化程度.
结果：第12天ELISA检测细胞外IFN-γ分泌量,结果提示实验组明显高于对照组,流式细胞仪检测细胞内TNF-α、IFN-γ的分泌水平实验组也明显高于对照组,实验组CD137的表达水平明显高于对照组,均有统计学差异;而CD28均高水平表达.
结论：成熟度较高的DC可诱导初始T淋巴细胞活化程度更高,并大量分泌TNF-α、IFN-γ,同时高表达CD28、CD137.
第三部分：poly(I：C)刺激的成熟DC,及其诱导的活化T细胞对患者短期内免疫功能的影响
目的：探讨poly(I：C)较TNF-α刺激的成熟DC,对增强患者的免疫功能是否有更强的作用.
方法：在得到伦理验证,患者签署协议后,给予回输poly(I：C)刺激的成熟DC,及DC诱导的活化T细胞,在第3疗程后,于第4疗程回输细胞前检测患者体内CD3+、CD4+、CD8+、CD56+、Treg、MDSC、IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ等指标,与患者利用TNF-α刺激DC成熟的方案至少3疗程后,患者体内CD3+、CD4+、CD8+、CD56+、Treg、MDSC、IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ等指标比较.
结果：根据CD3+、CD4+、CD8+、CD56+、及CD4+/CD8+的比值变化对免疫功能变化的反映,及两组细胞因子分泌量与免疫功能成正比,Treg、MDSC指标与免疫功能成反比,提示实验组免疫功能明显强于对照组.
结论：Poly(I：C)刺激的成熟DC,对增强患者的免疫功能有更强的作用.
DC是目前被广泛认可的抗原递呈功能最强的专职抗原递呈细胞(antigen presenting cell,APC),成熟DC具有很强的诱导初始T细胞活化,激活免疫应答的功能,是固有免疫中巨噬细胞和适应性免疫中B细胞功能的100~1000倍.但目前临床应用的DC其成熟度与疗效所需的成熟度仍有差距,这也许是DC-CIK细胞免疫治疗已大量应用于肿瘤治疗中,并得到一定的认可,但疗效仍有限的原因之一.
自1996年JulesA.Hoffmann等报告了Toll样受体(Toll-like receptor TLR)在果蝇成虫真菌感染激起的固有免疫应答过程中发挥不可或缺的作用,国内外开始大量研究TLR的配体刺激DC成熟的方案,并得到广泛证实.TLR3特异性高表达于DC细胞,poly(I：C)(polyinosinic-polycytidylic acid聚肌胞苷酸,聚肌苷酸-聚胞苷酸)是TLR3的配体,DC细胞膜上的TLR3可识别并结合poly(I：C),介导非依赖MyD88性途径,起始信号通路,诱导产生I型IFN,并通过IFN-α/β所介导的信号途径促进DC成熟.本课题主要研究poly(I：C)较传统刺激DC成熟物质TNF-α(Tumor necrosis factor-α肿瘤坏死因子α)对影响DC成熟度是否不同,及DC的成熟度不同对初始T淋巴细胞的活化程度是否有影响,最后应用于患者,探讨对患者体内免疫功能是否有更好的作用.
第一部分：Poly(I：C)刺激DC的成熟及鉴定
目的：明确poly(I：C)是否可以提高DC成熟度.
方法：血细胞分离机分离患者外周血PBMC(外周血单个核细胞peripheral blood mononuclear cell),体外培养,以贴壁法获取DC,第0天和第4天用GM-CSF(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor粒细胞巨噬细胞刺激因子)、IL-4(Interleukin4白介素4)刺激DC分化,第6天加入腺病毒负载多抗原,第7天实验组加入poly(I：C)+IFN-γ,对照组加入TNF-α,第8天收获DC并检测其成熟度.
结果：连续第7、8、9天检测胞外IL-12分泌水平,发现在第8天分泌量最高,同时实验组分泌量显著高于对照组;结合ELISA结果,第8天检测DC表面表型的表达,同样发现实验组CD80和HLA-DR表达较对照组明显升高,有统计学差异;CD83和CD86表达也较对照组有所升高.
结论：Poly(I：C)可有效刺激DC成熟,并高表达CD80、CD83、CD86和HLA-DR,同时大量分泌IL-12.
第二部分：不同成熟度的DC对T细胞的活化程度的影响、及其活性分析
目的：探讨不同成熟度DC,对诱导初始T淋巴细胞活化程度的影响.
方法：第8天按细胞数初始T淋巴细胞：DC=20：1,计算相同细胞数,将实验组和对照组DC与初始T淋巴细胞共培养,同时加入一定比例IL-2一同刺激T细胞活化,第10天加入相同数量DC及同比例IL-2,共培养过程中光镜观察T细胞形态变化,第12天收获T细胞并检测其活化程度.
结果：第12天ELISA检测细胞外IFN-γ分泌量,结果提示实验组明显高于对照组,流式细胞仪检测细胞内TNF-α、IFN-γ的分泌水平实验组也明显高于对照组,实验组CD137的表达水平明显高于对照组,均有统计学差异;而CD28均高水平表达.
结论：成熟度较高的DC可诱导初始T淋巴细胞活化程度更高,并大量分泌TNF-α、IFN-γ,同时高表达CD28、CD137.
第三部分：poly(I：C)刺激的成熟DC,及其诱导的活化T细胞对患者短期内免疫功能的影响
目的：探讨poly(I：C)较TNF-α刺激的成熟DC,对增强患者的免疫功能是否有更强的作用.
方法：在得到伦理验证,患者签署协议后,给予回输poly(I：C)刺激的成熟DC,及DC诱导的活化T细胞,在第3疗程后,于第4疗程回输细胞前检测患者体内CD3+、CD4+、CD8+、CD56+、Treg、MDSC、IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ等指标,与患者利用TNF-α刺激DC成熟的方案至少3疗程后,患者体内CD3+、CD4+、CD8+、CD56+、Treg、MDSC、IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ等指标比较.
结果：根据CD3+、CD4+、CD8+、CD56+、及CD4+/CD8+的比值变化对免疫功能变化的反映,及两组细胞因子分泌量与免疫功能成正比,Treg、MDSC指标与免疫功能成反比,提示实验组免疫功能明显强于对照组.
结论：Poly(I：C)刺激的成熟DC,对增强患者的免疫功能有更强的作用.