【摘 要】
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采用同源重组原理进行基因敲除,需要构建有效的打靶载体,但是目前常用的基因打靶载体在一次打靶中只敲除目标基因的一个等位靶基因,如要敲除一对等位基因,其操作和筛选都较困难。为解决这一技术难点,本研究构建了一个通用型等位基因双敲除打靶系统,并且对该系统进行了验证。该等位基因双敲除打靶系统由pGT-V1和pGT-V2两个互补的打靶载体组成,分别带有新霉素基因/绿色荧光蛋白基因（Neo/EGFP）和潮霉素基
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采用同源重组原理进行基因敲除,需要构建有效的打靶载体,但是目前常用的基因打靶载体在一次打靶中只敲除目标基因的一个等位靶基因,如要敲除一对等位基因,其操作和筛选都较困难。为解决这一技术难点,本研究构建了一个通用型等位基因双敲除打靶系统,并且对该系统进行了验证。该等位基因双敲除打靶系统由pGT-V1和pGT-V2两个互补的打靶载体组成,分别带有新霉素基因/绿色荧光蛋白基因（Neo/EGFP）和潮霉素基因/红色荧光蛋白基因（Hyg/DsRed）,并且都含有负筛选标记基因单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（TK）。研究以pIRES-Neo质粒为骨架,构建了两个双顺反子表达载体pIRES-Neo-GFP和pIRES-Hyg-RED;然后,将两段包含“8碱基”酶切位点的多克隆位点序列MCS1和MCS2分别插入到pBS246载体上两个LoxP片段外侧;再将包含启动子和PolyA结构的HSV1tk基因片段克隆到MCS1和MCS2之间;最后,通过将两个双顺反子结构分别插入到重组后的pBS246/MCS/TK的多克隆位点上,分别得到pGT-V1和pGT-V2。通过电转染的方法将两个打靶载体分别转入到C2C12细胞中,通过荧光观察和抗生素测试以及流式细胞仪等验证手段证明载体上的功能元件工作正常。为了进一步验证打靶载体的打靶能力,建立完善的等位基因双敲除打靶程序,本研究克隆了小鼠MSTN两段同源序列作为打靶同源臂,将其分别插入到两个打靶载体的多克隆位点,完成小鼠MSTN基因打靶载体pGTV1-SA-LA和pGTV2-SA-LA的构建。并且通过“模拟PCR”对打靶后期利用PCR方法检测中靶阳性克隆的条件进行摸索,建立了稳定的检测体系。本研究成功构建并验证了用于等位基因双敲除的打靶载体系统,获得了小鼠MSTN等位基因敲除载体,这项研究为将来创建MSTN基因敲除细胞模型工作奠定了基础。
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