背景:乙型肝炎发病机制复杂,受病毒、宿主及二者相互作用的影响,病毒方面包括病毒蛋白、基因型等,而宿主方面的则主要包括宿主遗传背景、免疫状态因素等,宿主与病毒因素间平衡是影响疾病进展与转归的核心环节。核苷(酸)类似物(Nucleoside/Nucleotide analogues,NAs)是一类口服抗乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)药物,主要作用机制是其进入细胞内首先成为三磷酸化合物,通过与底物的竞争,抑制病毒的聚合酶或反转录酶,终止HBV DNA链的延长。近来研究表明,NAs可能还具有免疫调节作用。对服用NAs抗病毒治疗的慢性乙型病毒性肝炎(Chronic hepatitis B,CHB)患者的研究表明:NAs治疗可以调节Th1/Th2平衡,改善Treg细胞增殖,促进机体免疫功能的增强或恢复。临床中NAs抗HBV感染的疗效具有个体差异性,其影响因素除病毒基因型外,宿主的遗传背景也具有很大作用,而宿主的遗传背景主要由单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)决定。SNP指由单个核苷酸A、T、C或G的改变而引起的DNA序列的改变,从而造成的不同物种间或人体内染色体基因组的多样性。SNP构成人类基因组90%以上的变异,广泛用于连锁分析与基因定位、疾病易感性、群体遗传学与进化生物学、药物基因组、环境基因组学等研究。目前文献报道的与HBV感染预后相关的SNP包括:人类白细胞抗原结构区的HLA DRBA*1302、MHC-I、II位点,非人类白细胞抗原结构区的肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ、雌激素受体-α、甘露糖结合蛋白、维生素D受体、白介素-10、干扰素γ诱导的蛋白-10、程序性细胞死亡因子-1等基因。程序性细胞死亡因子-1(Programmed celll death-1,PD-1)属于CD28家族和Ig超家族,是一种相对分子质量约50-55KDa的I型跨膜蛋白,表达于活化的CD4+和CD8+T细胞、B细胞和骨髓细胞,在未活化的淋巴细胞不表达。慢性HBV感染时,肝细胞表面过度表达PD-1的配体PD-L1,通过PD-1/PD-L1信号通路抑制CD8+T细胞的表达,T细胞耗竭导致IFN-γ、TNF-α等抗病毒细胞因子的表达减少,病毒持续存在。PD-1的不同等位基因的表达在HBV感染患者、肝硬化患者和健康人群中不同,且其内含子的SNP与外周血病毒载量相关。最近研究发现在HBV和HIV/HBV感染的CHB患者中,外周血Treg细胞的扩增与HBV DNA载量相关且表现为抑制HBV特异性免疫反应;阿德福韦酯治疗可阻断PD-1受体表达,抑制HBV复制,减少Treg细胞数量和功能,显著提高HBV特异性CD8+T效应细胞,从而增强免疫应答。目前关于PD-1在HBV慢性感染中的作用研究尚未十分明确,PD-1单核苷酸多态性与HBV感染自发清除和抗HBV疗效的研究较少,且研究结果不一致,NAs抗病毒治疗与PD-1及其相关因子是否存在关联,是否能够影响宿主的免疫功能尚存在争议。目的:本研究通过测定HBV感染自发清除者、CHB患者(包括NAs治疗者和未抗HBV者)及HBV相关慢加急性肝衰竭(Acute-on-chronic liver failure,ACLF)患者血清及肝组织表达PD-1的水平,探讨不同HBV感染阶段PD-1的水平的变化,评价NAs对PD-1表达水平的影响,分析血清PD-1与慢性HBV感染者临床生化指标及病毒载量的相关性,探讨PD-1在HBV感染发展及转归中的作用。通过测定HBV感染自发清除者、CHB患者(包括NAs治疗者和未抗HBV者)及HBV相关慢加急性肝衰竭(Acute-on-chronic liver failure,ACLF)患者血清PD-1、IL-10、IFN-γ水平,HBV DNA载量,以及外周血HBV特异性CD8+T细胞频率,探讨NAs对PD-1/PD-L1抑制通路的影响,及对宿主免疫功能的作用。通过分析不同HBV感染状态人群及NAs治疗不同应答患者的SNP,探索PD-1的SNP在HBV感染预后转归中的作用,及其与NAs抗HBV治疗的关系,证实NAs在抗HBV治疗中免疫调节的作用,研究PD-1等位基因在抗HBV治疗中的作用。方法:1慢性HBV感染患者程序性细胞死亡因子-1水平变化与意义筛选河北医科大学第三医院感染科自2013年10月至2015年1月的病例:(1)慢性HBV感染病例:CHB病例符合2010年中华医学会肝病学分会和感染病学分会制订的《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准,并且排除有其他肝炎病毒合并感染者。HBV-ACLF病例诊断符合我国2012年中华医学会感染病学分会肝衰竭与人工肝学组、中华医学会肝病学分会重型肝病与人工肝学组制定的《肝衰竭诊疗指南》,抗HBV治疗者要求服用NAs单药或联合治疗,未抗HBV治疗者要求不曾使用任何NAs和/或干扰素抗病毒治疗。(2)自发清除病例:抗-HBs、抗-HBe、抗HBc两项或三项均阳性,HBV DNA阴性,肝功能正常,肝胆脾超声检查正常,未曾接受过任何抗病毒治疗的既往HBV感染者。病例排除标准:(1)合并妊娠及HAV、HCV、HDV、HEV、HIV、EBV、CMV等其他病毒感染者;(2)NAs与干扰素或中药合用者;(3)患者伴有恶性肿瘤、严重免疫系统疾病、血液系统疾病或明显精神病史。收集临床资料包括:性别、年龄、诊断、治疗、用药时间。NAs治疗病例均定期检查肝功能(ALT、ALB、TB)、HBV病毒标记物(HBs Ag、抗-HBs、HBe Ag、抗-HBe、抗-HBc)、HBV DNA载量。使用全自动生化分析仪检测所有入组患者ALB、ALT、TB等血清生化指标;全自动血凝仪检测PTA、INR;实时荧光定量PCR检测HBV DNA载量(检测下限为500copies/ml);抗体夹心酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清PD-1含量;Westernblot检测肝组织中PD-1蛋白的表达水平。统计学分析采用IBM SPSS Statistics 19统计软件,计量资料以(mean±SD)表示,数据分析前进行正态性及方差齐性检验。若数据为正态分布且方差齐同(P>0.05)则应用t检验进行比较,若方差不齐(P<0.05)则应用t’检验进行比较,多组之间比较应用单因素方差分析,组间比较采用LSD检验;若数据呈非正态分布或方差不齐时,采用Kruskal Wallis H秩和检验。计数资料采用χ2检验。相关性分析采用Spearman等级相关分析。按α=0.05水准,双侧P<0.05为差异有统计学意义。2 HBV介导的PD-1/PD-L1抑制通路在慢性乙型病毒性肝炎疾病进展中的作用筛选河北医科大学第三医院感染科自2013年10月至2015年1月的病例:(1)慢性HBV感染病例:CHB病例符合2010年中华医学会肝病学分会和感染病学分会制订的《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准,并且排除有其他肝炎病毒合并感染者。HBV-ACLF病例诊断符合我国2012年中华医学会感染病学分会肝衰竭与人工肝学组、中华医学会肝病学分会重型肝病与人工肝学组制定的《肝衰竭诊疗指南》,抗HBV治疗为服用NAs单药或联合治疗。(2)自发清除病例:抗-HBs、抗-HBe、抗HBc两项或三项均阳性,HBV DNA阴性,肝功能正常,肝胆脾超声检查正常,未曾接受过任何抗病毒治疗的既往HBV感染者。病例排除标准:(1)合并妊娠及HAV、HCV、HDV、HEV、HIV、EBV、CMV等其他病毒感染者;(2)NAs与干扰素或中药合用者;(3)患者伴有恶性肿瘤、严重免疫系统疾病、血液系统疾病或明显精神病史。收集临床资料包括:性别、年龄、诊断、治疗、用药时间。NAs治疗病例均定期检查肝功能(ALT、ALB、TB)、HBV病毒标记物(HBs Ag、抗-HBs、HBe Ag、抗-HBe、抗-HBc)、HBV DNA载量。使用全自动生化分析仪检测所有入组患者ALB、ALT、TB等血清生化指标;实时荧光定量PCR检测HBV DNA载量(检测下限为500copies/ml);ELISA检测血清PD-1、IL-10、IFN-γ含量;取清晨空腹外周静脉血3ml应用流式细胞仪检测外周血HBV特异性CD8+T细胞。统计学分析采用IBM SPSS Statistics 19统计软件,计量资料以(mean±SD)表示,数据分析前进行正态性及方差齐性检验。若数据为正态分布且方差齐同(P>0.05)则应用t检验进行比较,若方差不齐(P<0.05)则应用t’检验进行比较,多组之间比较应用单因素方差分析,组间比较采用LSD检验;若数据呈非正态分布或方差不齐时,采用Kruskal Wallis H秩和检验。计数资料采用χ2检验。相关性分析采用Spearman等级相关分析。按α=0.05水准,双侧P<0.05为差异有统计学意义。3程序性细胞死亡因子-1单核苷酸多态性与抗HBV感染疗效的相关性分析筛选河北医科大学第三医院感染科自2013年10月至2014年8月HBV感染病例195例。病例纳入标准:(1)HBV感染病例:CHB病例符合2010年中华医学会肝病学分会和感染病学分会制订的《慢性乙型肝炎防治指南》诊断标准,并且排除有其他肝炎病毒合并感染者。HBV-ACLF病例诊断符合我国2012年中华医学会感染病学分会肝衰竭与人工肝学组、中华医学会肝病学分会重型肝病与人工肝学组制定的《肝衰竭诊疗指南》,抗HBV治疗为服用NAs单药或联合治疗。(2)自发清除病例:抗-HBs、抗-HBe、抗HBc两项或三项均阳性,HBV DNA阴性,肝功能正常,肝胆脾超声检查正常,未曾接受过任何抗病毒治疗的既往HBV感染者。病例排除标准:(1)合并妊娠及HAV、HCV、HDV、HEV、HIV、EBV、CMV等其他病毒感染者;(2)NAs与干扰素或中药合用者;(3)患者伴有恶性肿瘤、严重免疫系统疾病、血液系统疾病或明显精神病史。疗效判定:NAs治疗12周时血清HBV DNA应用PCR法检测不到或低于检测下限(500copies/ml),或较基线下降≥2log10为早期应答者;12周时HBV DNA载量较基线下降<2log10为非早期应答者。NAs治疗4周时血清HBV DNA应用PCR法检测不到或低于检测下限(500copies/ml),或较基线下降≥2log10为快速应答者;4周时HBV DNA载量较基线下降<2log10为非快速应答者。取清晨空腹外周静脉血3ml,应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析法,测定rs10204525、rs2227982、rs7421861和rs6710479的基因型,分析这四个位点等位基因分布频率与HBV感染自发清除和NAs抗HBV疗效的关系。采用IBM SPSS Statistics 19软件进行数据分析,率的比较采用卡方检验,当出现P≈a或n<40时,用Fisher精确概率法进行计算,全部检验均为双侧检验,P<0.05为差异有统计学意义。应用SHEsis软件进行Hardy-Weinberg平衡分析,对照组P>0.05为符合遗传平衡定律。结果:1慢性HBV感染患者程序性细胞死亡因子-1水平变化与意义1.1纳入病例的人口学特点与临床资料。本研究共纳入86例病例。CHB组46例(未抗病毒治疗组23例,NAs抗病毒治疗组23例),ACLF组20例,HBV自发清除组20例。各组病例性别和年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。CHB未抗病毒治疗组病例HBV DNA载量、ALT水平显著高于NAs抗病毒治疗组病例(P<0.05),两组间TB、ALB水平比较无差异(P>0.05)。HBV自发清除组ALB水平显著高于CHB组和ACLF组(P<0.05),ALT、TB水平均显著低于CHB组和ACLF组(P<0.05)。CHB组ALB水平显著高于ACLF组(P<0.05),HBV DNA载量、ALT、TB水平均显著低于ACLF组(P<0.05)。1.2 CHB未抗病毒治疗组、CHB NAs抗病毒治疗组、ACLF组和HBV自发清除组间血清PD-1水平比较。ACLF组血清PD-1水平(17.542±2.265ng/ml)显著高于CHB未抗病毒治疗组(15.533±2.194 ng/ml)、CHB NAs抗病毒治疗组(12.849±2.193 ng/ml)及HBV自发清除组(10.641±4.192ng/ml),差异均具有统计学意义(P<0.001)。CHB未抗病毒治疗组血清PD-1水平显著高于CHB NAs抗病毒治疗组及HBV自发清除组,CHB NAs抗病毒治疗组血清PD-1水平显著高于HBV自发清除组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。1.3 CHB未抗病毒治疗组、CHB NAs抗病毒治疗组、ACLF组和HBV自发清除组间肝组织PD-1蛋白表达比较。共40例病例接受肝脏PD-1蛋白表达检测,CHB未抗病毒治疗组10例,CHB NAs抗病毒治疗组10例,ACLF组10例和HBV自发清除10例。Westernblot检测示:ACLF组PD-1蛋白表达水平(1.274±0.362)显著高于CHB未抗病毒治疗组(1.074±0.088)、CHB NAs抗病毒治疗组(0.813±0.156)及HBV自发清除组(0.593±0.116),差异均具有统计学意义(P<0.001)。CHB未抗病毒治疗组PD-1蛋白表达水平显著高于CHB NAs抗病毒治疗组及HBV自发清除组,CHB NAs抗病毒治疗组PD-1蛋白水平显著高于HBV自发清除组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。1.4血清PD-1水平与HBV DNA载量、ALT、TB及ALB相关性分析。CHB组和ACLF组病例血清PD-1水平与HBV DNA载量均成正相关(r=0.568,P<0.001;r=0.729,P<0.001)。CHB组病例血清PD-1水平与ALT水平成正相关(r=0.373,P=0.011),与ALB水平呈负相关(r=-0.457,P=0.001),与TB水平无明显相关(P>0.05)。ACLF组病例血清PD-1水平与ALB水平呈负相关(r=-0.756,P<0.001),与ALT和TB水平无明显相关(P>0.05)。2 HBV介导的PD-1/PD-L1抑制通路在慢性乙型病毒性肝炎疾病进展中的作用2.1纳入病例的人口学特点与临床资料。本研究共纳入86例病例。CHB组46例(未抗病毒治疗组23例,NAs抗病毒治疗组23例),ACLF组20例,HBV自发清除组20例。各组病例性别和年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。HBV自发清除组ALB水平显著高于CHB组和ACLF组(P<0.05),ALT、TB水平均显著低于CHB组和ACLF组(P<0.05)。CHB组ALB水平显著高于ACLF组(P<0.05),HBV DNA载量、ALT、TB水平均显著低于ACLF组(P<0.05)。CHB未抗病毒治疗组病例HBV DNA载量、ALT水平显著高于NAs抗病毒治疗组病例(P<0.05),两组间TB、ALB水平比较无差异(P>0.05)。2.2血清学指标分析2.2.1血清PD-1水平比较。结果同第一部分。2.2.2血清IL-10水平比较。ACLF组血清IL-10水平(62.43±21.93 pg/ml)显著高于CHB未抗病毒治疗组(41.59±16.46 pg/ml)、CHB NAs抗病毒治疗组(25.10±11.94 pg/ml)及HBV自发清除组(20.83±9.71 pg/ml),差异均具有统计学意义(P<0.001)。CHB未抗病毒治疗组血清IL-10水平显著高于CHB NAs抗病毒治疗组及HBV自发清除组(P<0.01),CHB NAs抗病毒治疗组血清IL-10水平与HBV自发清除组比较无显著差异(P>0.05)。2.2.3血清IFN-γ水平比较。ACLF组血清IFN-γ水平(79.08±31.79 pg/ml)显著高于CHB未抗病毒治疗组(32.66±20.47 pg/ml)、CHB NAs抗病毒治疗组(51.95±25.58 pg/ml)及HBV自发清除组(58.63±17.7 pg/ml),差异均具有统计学意义(P<0.001)。CHB未抗病毒治疗组血清IFN-γ水平显著低于CHB NAs抗病毒治疗组及HBV自发清除组(P<0.01),CHB NAs抗病毒治疗组血清IFN-γ水平与HBV自发清除组比较无显著差异(P>0.05)。2.3外周血HBV特异性CD8+T细胞频率比较。ACLF组外周血HBV特异性CD8+T细胞频率(0.85±0.39%)显著高于CHB未抗病毒治疗组(0.21±0.25%)、CHB NAs抗病毒治疗组(0.41±0.47%)及HBV自发清除组(0.00±0.00%),差异均具有统计学意义(P<0.001)。CHB NAs抗病毒治疗组外周血HBV特异性CD8+T细胞频率显著高于CHB未抗病毒治疗组及HBV自发清除组(P<0.05),CHB NAs未抗病毒治疗组外周血HBV特异性CD8+T细胞频率明显高于HBV自发清除组(P<0.05)。2.4相关性分析2.4.1 HBV DNA载量与血清PD-1、IL-10、IFN-γ水平相关性分析。CHB组和ACLF组HBV DNA载量与血清PD-1水平均成正相关(r=0.568,P<0.001;r=0.729,P<0.001),与血清IL-10水平均成正相关(r=0.541,P<0.001;r=0.560,P=0.01),与血清IFN-γ水平均成负相关(r=-0.319,P<0.05;r=-0.832,P<0.001)。2.4.2外周血HBV特异性CD8+T细胞频率与血清PD-1水平和HBV DNA载量相关性分析。CHB组外周血HBV特异性CD8+T细胞频率与血清PD-1水平成正相关(r=0.438,P=0.002),与HBV DNA载量不相关(r=0.072,P=0.634)。ACLF组外周血HBV特异性CD8+T细胞频率与血清PD-1水平和HBV DNA载量均成正相关(r=0.838,P<0.001;r=0.595,P=0.006)。3程序性细胞死亡因子-1单核苷酸多态性与抗HBV感染疗效的相关性分析3.1纳入病例的人口学特点与临床资料。共纳入195例病例,CHB组90例(早期应答者65例,非早期应答者25例),ACLF组45例(快速应答者30例,非快速应答者15例),HBV自发清除组60例。CHB组、ACLF组和自发清除组间病例年龄、性别均无统计学差异(P>0.05)。CHB组中的早期应答者和非早期应答者间,ACLF组中的快速应答者和非快速应答者间,年龄、性别,NAs治疗前的HBV DNA载量、ALT、TB、ALB水平均无显著差异(P>0.05)。3.2等位基因分布频率与抗HBV感染的关系。3.2.1 rs10204525基因型等位基因A的出现频率CHB组(76.7%)、ACLF组(67.8%)和HBV自发清除组(75.8%)间差异无统计学意义(χ2=2.684,P=0.261);组间比较显示等位基因A的出现频率在HBV自发清除组(75.8%)与慢性HBV感染组(CHB组+ACLF组)(73.7%)间(χ2=0.955,P=0.328),CHB组和ACLF组间(χ2=2.446,P=0.118)均无统计学差异(P>0.05)。CHB组早期应答者等位基因A的出现频率(80.8%)高于非早期应答者(66.0%),差异具有统计学意义(χ2=4.403,P=0.036);ACLF组快速应答者等位基因A的出现频率(75.0%)高于非快速应答者(53.3%),差异具有统计学意义(χ2=4.299,P=0.038)。3.2.2 rs6710479基因型等位基因A的出现频率HBV自发清除组(59.2%)低于CHB组(73.3%)和ACLF组(68.9%),三组间差异具有统计学意义(χ2=54.052,P<0.001);组间比较显示HBV自发清除组(59.2%)等位基因A的出现频率低于慢性HBV感染组(CHB组+ACLF组)(71.9%),差异具有统计学意义(χ2=6.138,P=0.013),CHB组和ACLF组间等位基因分布差异无统计学意义(χ2=0.586,P=0.444)。CHB组早期应答者和非早期应答者间(χ2=3.084,P=0.079),ACLF组快速应答者和非快速应答者间(χ2=1.435,P=0.231)等位基因A的出现频率均无统计学意义(P>0.05)。3.2.3 rs2227982和rs7421861基因型等位基因分布频率在HBV自发清除组、CHB组、ACLF组间,HBV自发清除组和慢性HBV感染组(CHB组+ACLF组)间,CHB组和ACLF组间,CHB组早期应答者和非早期应答者间,及ACLF组快速应答者和非快速应答者间比较差异均无统计学意义(P>0.05)3.3遗传平衡检验。应用SHEsis软件进行Hardy-Weinberg平衡分析,rs10204525 CHB组早期应答者(P<0.001)和非早期应答者(P=0.922)符合遗传平衡定律,ACLF组快速应答者(P=0.039)和非快速应答者(P=0.447)符合遗传平衡定律;rs6710479慢性HBV感染组(P=0.011)和HBV自发清除组(P=0.286)符合遗传平衡定律。结论:1 PD-1的表达与HBV感染者疾病进展相关联。2 NAs抗HBV治疗通过抑制HBV复制,促进HBV特异性CD8+T细胞产生,降低PD-1/PD-L1信号通路中PD-1的表达,调节Th1/Th2平衡,改善宿主的免疫功能。3 PD-1 rs6710479基因等位基因A不利于病毒自发清除,易导致HBV感染慢性化;rs10204525基因等位基因A有利于NAs抗HBV的治疗应答。