恶性黑素瘤(malignant melanoma)是来源于黑色素细胞的恶性肿瘤,发病率为全身恶性肿瘤的1%—2%,其恶性程度高,预后差。随着分子生物学的发展,基因治疗给恶性肿瘤的治疗带来了曙光,恶性黑素瘤是最早进行基因治疗的恶性肿瘤之一。肿瘤的基因治疗,特别是肿瘤的自杀基因疗法,已经成为继传统的手术切除、放疗、化疗等方法后的一种新的抗肿瘤治疗措施。但单纯自杀基因治疗由于目前载体转染效率较低、靶向性不够等问题没解决,仍有部分肿瘤细胞残余导致肿瘤复发,这是该疗法存在的重大缺陷。因而增强旁杀伤效应目前已成为提高肿瘤自杀基因治疗疗效的重要策略。由于缝隙连接机制是旁杀伤效应的重要机制,故改善肿瘤的细胞间缝隙连接功能(GJIC)是自杀基因疗法增效的重要途径之一。以往的研究证明:六味地黄丸能够提高自杀基因的旁杀伤效应,而缝隙连接机制是旁杀伤效应的重要机制之一,故推测六味地黄丸可能具有提高GJIC功能的作用。本研究应用中药复方血清药理学的方法,以小鼠恶性黑色素瘤B16细胞为研究对象,初步探讨六味地黄丸含药血清对小鼠恶性黑色素瘤增效作用的旁杀伤效应机制。通过研究以期为临床自杀基因疗法联合中药复方的中西医结合治疗方案的建立提供实验数据、科学依据及前期工作基础。目的:本实验旨在以往研究的基础上,应用中药复方血清药理学方法,研究六味地黄丸含药血清对小鼠恶性黑色素瘤细胞(B16细胞)旁杀伤效应增效作用的缝隙连接机制。方法:1六味地黄丸药物血清和对照血清的制备:SD大鼠(230～280g),分为对照组和六味地黄丸给药组(药物剂量为等效剂量的6～8倍)。灌胃八天。末次给药后1小时腹主动脉取血,-70℃冰箱保存备用。2六味地黄丸药物血清和对照血清添加量的确定:MTT法检测检测B16细胞对六味地黄丸含药血清和对照血清的敏感程度,确定用药浓度。3六味地黄丸含药血清对恶性黑色素瘤GJIC功能的影响:用流式细胞技术检测和SLDT法观察六味地黄丸含药血清对B16细胞的GJIC功能的影响。4六味地黄丸含药血清对恶性黑色素瘤细胞的缝隙连接蛋白Cx的影响:用western blot技术和间接免疫荧光技术检测六味地黄丸含药血清对恶性黑色素瘤细胞的缝隙连接蛋白Cx的影响。结果:1.血清的制备及含药血清的添加量本实验给药方案采用每天灌胃2次,间隔8小时;灌胃后1h取血。从MTT结果来看,对照血清及六味地黄丸含药血清在5%～10%浓度下对小鼠恶性黑色素瘤细胞B16的生长有一定的促进作用,但是随着血清浓度增高(＞20%)会对细胞的形态产生明显的影响,镜下观察细胞形态发生空泡状改变。但数量上还是有所增值的,故选择对B16细胞影响不大的浓度(＜10%)作为大鼠血清的工作浓度。但六味地黄丸含药血清与对照血清对细胞影响无统计学差异(P＞0.05)。2六味地黄丸含药血清对恶性黑色素瘤细胞GJIC功能的影响SLDT法和流式细胞仪技术检测的结果都是:对照血清和含药血清都使得B16细胞GJIC功能得到增强,至于大鼠血清为什么使得GJIC功能增强,具体机制有待进一步研究,但是单看六味地黄丸含药血清组可以看出有一个量效关系,随着浓度的增加,其GJIC功能得到增强,说明六味地黄丸含药血清能够提高小鼠恶性黑色素瘤细胞的GJIC功能。3六味地黄丸含药血清对恶性黑色素瘤细胞的缝隙连接蛋白的影响Western blot技术和FITC检测结果显示:对照血清和六味地黄丸含药血清都使得Cx蛋白的表达提高,至于对照血清为什么能够提高Cx的表达,具体机制不明,有待进一步研究。单看六味地黄丸含药血清也能使Cx提高。且有明显的量效关系。说明六味地黄丸含药血清能够使小鼠恶性黑色素瘤细胞的Cx的表达有所提高。结论:本研究在细胞水平探讨了六味地黄丸含药血清对小鼠恶性黑色素瘤细胞自杀基因疗法旁杀伤增效的作用机制。研究结果表明,六味地黄丸可能通过增强恶性黑色素瘤细胞Cx表达,从而增强缝隙连接功能,故旁杀伤效应的缝隙连接机制,可能是六味地黄丸对自杀基因疗法增效的机制之一。