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研究背景近现代外科手术的快速发展和手术量的增加使得术后疼痛的患者群体逐渐增多,但现今的术后疼痛管理仍然不是最理想的。全世界每年接受手术的患者中有将近10%发展为慢性术后疼痛,这其中有部分可能是由于术后急性疼痛管理不充分所导致。目前,阿片类药物仍然是临床急性术后疼痛管理中最主要的药物,但是恶心,呕吐等副作用大大限制了患者的依从性,且有药物滥用的风险。因此临床上亟需新的镇痛方法。河豚毒素（tetrodotoxin,TTX）是一种特殊的天然神经毒素,它高选择性和高亲和性地阻断神经兴奋性细胞膜上的电压门控钠离子通道。越来越多的研究表明,TTX通过影响河豚毒素敏感型（tetrodotoxin-sensitive,TTX-S）钠通道,在多种疼痛模型,如急性和炎性痛、神经病理性痛、癌痛等疼痛模型中表现出镇痛效应。然而,目前尚未有TTX在急性术后疼痛中的研究报道。我们推测TTX的抗伤害性感受的作用可能与阻滞部分TTX-S钠通道及其抗炎症因子作用有关。近年来,随着“多模式镇痛”的概念的提出,术后疼痛管理有了更多的药物和技术的选择。理论上,由于不同药物的作用机制和副作用不同,使用不同药理学作用的镇痛药物组合来管理围术期疼痛可以提高疼痛治疗的安全性和有效性。具有最强镇痛作用的阿片系统,是疼痛研究中一个被广泛关注的研究对象,而且有研究表明钠通道可能参与阿片系统的调控,因此,本研究观察TTX联合低剂量舒芬太尼在大鼠急性术后疼痛模型中的抗伤害性感受的作用,推测TTX可能通过增加内源性阿片肽和阿片受体的表达来增强舒芬太尼的抗伤害性感受的作用。因此,本研究拟建立大鼠急性术后疼痛模型,分别采用皮下单独注射TTX和联合舒芬太尼注射,检测单独注射TTX对炎症因子和TTX-S钠通道m RNA和蛋白水平的影响,采用q PCR和western blot检测TTX与舒芬太尼联合应用对前脑啡肽（proenkephalin,PENK）、μ阿片受体（opioid receptorμ1,OPRM1）、δ阿片受体（opioid receptorδ1,OPRD1）和κ阿片受体（opioid receptorκ1,OPRK1）的m RNA和蛋白表达的影响,从而验证科学假说。本课题探讨了TTX在急性术后疼痛中的镇痛作用及其可能的机制,并将其与舒芬太尼联合应用,为多模式镇痛提供更多的选择,有望从新的角度解读钠通道阻滞剂与强阿片药物合用的科学性。研究方法与结果第一部分皮下注射河豚毒素在大鼠急性术后疼痛中的作用及机制方法:1.将40只成年雄性SD（Spraque Dawley,SD）大鼠随机分成control+NS组,control+TTX组,PI+NS组,PI+TTX组,每组10只。给药方式如下:control+NS组:吸入异氟烷麻醉后皮下注射NS;control+TTX组:吸入异氟烷麻醉后皮下注射TTX（6μg/kg）;PI+NS组:异氟烷麻醉后建立大鼠足底切口痛模型（plantar incision,PI）,术后5分钟皮下给予同样体积的NS;PI+TTX组:同样建立PI模型后皮下给予TTX（6μg/kg）。2.分别在术前（-3d～-1d）和术后1h、2h、4h、6h、24h进行机械缩爪阈值（mechanical paw withdrawal threshold,MPWT）测试,采用q PCR和Western Blot方法检测术后24h大鼠L4-L6段DRG组织内IL-1β,TNF-αm RNA和蛋白水平,TTX-S钠通道的m RNA水平,采用ELISA方法检测术后24h大鼠血清样本中IL-1β,TNF-α因子水平。结果:1.行为学结果:与control+NS组相比,control+TTX组MPWT差异无统计学意义（p>0.05）,PI+NS组SD大鼠MPWT术后1 h开始明显下降（p<0.05）,;与PI+NS组相比,PI+TTX组大鼠1h MPWT明显升高（p<0.05）,且可持续至术后24h。2.分子水平检测结果:western blot和q PCR检测SD大鼠术后24h DRG组织。与control+NS组相比,PI+NS组大鼠DRG组织内IL-1β和TNF-α的m RNA水平明显升高（p<0.05）;与PI+NS组相比,PI+TTX组大鼠IL-1β和TNF-α的m RNA和蛋白水平明显降低（p<0.05）。TTX-S钠通道的q PCR结果显示,与control+NS组相比,PI+NS组Nav1.1,Nav1.6,Nav1.7的m RNA水平明显下降（p<0.05）;与PI+NS组相比,PI+TTX组大鼠组织Nav1.1,Nav1.3,Nav1.6,Nav1.7的m RNA水平升高（p0.05）,PI+NS组大鼠IL-1β和TNF-α水平显著升高（p<0.05）;与PI+NS组相比,PI+TTX组大鼠IL-1β和TNF-α水平显著降低（p<0.05）。第二部分河豚毒素联合舒芬太尼在大鼠急性术后疼痛中的作用及机制方法:1.将40只成年雄性SD大鼠随机分成PI+NS组,PI+TTX组,PI+Suf组,PI+TTX+Suf组,每组10只。给药方式如下:PI+NS组:异氟烷麻醉后建立PI模型,术后5分钟皮下给予同等体积的NS;PI+TTX组:同样建立PI模型后皮下给予TTX（6μg/kg）;PI+Suf组:同样建立PI模型后皮下给予Suf（5μg/kg）;PI+TTX+Suf组:同样建立PI模型后皮下给予TTX（6μg/kg）+Suf（5μg/kg）。2.分别在术前（-3d～-1d）和术后1h、2h、4h、6h、24h进行机械缩爪阈值测试,采用q PCR和western blot方法检测术后24h大鼠L4-L6段DRG组织内前脑啡肽（Preproenkephalin,PENK）,μ阿片受体（μopioid receptor 1,MOR1）,δ阿片受体（δopioid receptor 1,DOR1）及κ阿片受体（κopioid receptor 1,KOR1）的m RNA和蛋白水平。结果:1.行为学结果:当TTX与舒芬太尼联合应用时,PI+TTX+Suf组大鼠术后MPWT值相较于单独应用舒芬太尼上升更加显著（p0.05）,而PI+Suf组PENK及OPRM1出现下调（p<0.05）;PI+TTX+Suf组与PI+Suf组相比PENK,OPRM1及OPRD1的m RNA和蛋白水平出现上调（p0.05）。研究结论行为学结果表明PI模型大鼠建立成功,炎症因子的m RNA和蛋白水平升高,Nav1.1,Nav1.6,Nav1.7的m RNA水平升高,皮下注射TTX后PI大鼠机械性缩爪阈值明显缓解,并且炎症因子的m RNA和蛋白水平显著降低,Nav1.1,Nav1.3,Nav1.6,Nav1.7的m RNA水平降低。因此推测:TTX可能通过阻滞TTX-S型钠离子通道中的Nav1.1,Nav1.3,Nav1.6,Nav1.7,同时降低IL-1β和TNF-α等炎症因子的分泌发挥作用。TTX联合舒芬太尼应用可增强并延长低剂量舒芬太尼的术后镇痛效果,且此效应可能与前脑啡肽、μ阿片受体和δ阿片受体的m RNA和蛋白表达上调有关。