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(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(Ethyl(S)-4-chloro-3-hydroxybutanoate,(S)-CHBE)是一种重要的医药手性中间体,主要用于降血脂药物阿托伐他汀手性侧链的合成。另外,(S)-CHBE也可用于制备海洋溴吡咯生物碱、1,4-二氢吡啶类β-阻滞剂以及抗艾滋药物重要中间体(S)-3-羟基四氢呋喃。目前,利用生物法催化合成(S)-CHBE颇受研究者关注,但尚未见到规模化生产报道。因此研究(S)-CHBE生物法生产工艺、提高生物法生产效率有着重要的应用前景。本论文首先构建了羰基还原酶及葡萄糖脱氢酶双酶体系,以大肠杆菌为宿主,选择pCDFDute-1作为表达载体,成功构建共表达基因工程菌 coli BL21(DE3)/pCDFDuet-l-GDH6-6a,实验室保藏号为ZJB12065。并将其用于4-氯乙酰乙酸乙酯(ethyl 4-chloroaceto-acetate,COBE)的不对称还原反应中,催化产物经鉴定为(S)-CHBE,e.e.>99%。以ZJB12065为出发菌株,通过单因素优化确立其最佳发酵条件:蛋白胨 15 g/L,酵母粉 12 g/L,NaCl 10 g/L,(NH4)2S04 5g/L,甘油15 g/L,KH2PO4 1.36 g/L,K2HPO4·3H2O 2.28 g/L,MgSO4·7H2O 0.375 g/L,pH 7.0,灭菌后补加终浓度为50 μg/mL的链霉素。装液量100 mL/500 mL、接种量2%,于37℃、150 rpm培养2h后加入终浓度10 g/L的乳糖进行诱导,诱导条件为28℃、150 rpm、12 h。在上述条件下,菌体酶蛋白表达水平达到9093.78 U/L,为优化前的1.64倍,生物量达到4.07 g DCW/L,为优化前的1.75倍。在50 L、500 L发酵罐中进行放大培养,发酵罐菌体生物量较摇瓶水平提高了 2.42倍,体积酶活提高1.60倍,并在此基础上设计了 5 t发酵罐发酵工艺。本文系统考察了催化条件对共表达基因工程菌的影响,建立了两相催化体系,确定两相不对称还原反应最适条件为:35℃C,100 mL 100 mM、pH 7.0 KH2PO4-K2HPO4缓冲液与100 mL乙酸丁酯两相体系,将600 mM COBE,870 mM葡萄糖及15 g DCW/L细胞破碎液加入350 rpm磁力搅拌恒温水浴锅中进行反应,流加2 M NaOH控制pH 7.0。30 min时向体系中加入COBE 60 mM,葡萄糖87 mM,90 min后再加入COBE 50 mM,葡萄糖72.5 mM。反应4 h,转化率达到100%,(S)-CHBE 浓度为 1652.71 mM,产率 97%,时空产率 413.17 mM/h,为文献报道最高水平,单位菌体时空产率27.55 mM/h/g DCW,e.e.>99%。论文研究了产物(S)-CHBE的分离工艺,向反应液中加入2g/L活性炭,100 rpm搅拌30 min后过滤,以乙酸乙酯为萃取剂对水相中(S)-CHBE进行提取,萃取相比为0.2,萃取级数为5,同时对滤饼进行浸提,有机相经饱和NaHCO3或NaCl溶液洗涤,无水Na2SO4干燥,减压蒸馏即可得到淡黄色液体,总收率达到82%,产物纯度为95%。