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背景:MHC编码的产物在启动和调节免疫应答的过程中发挥重要作用。HLA-G基因座位位于人类MHC中,属于非经典HLA I类基因(Non-Classical class I gene),即HLA Ib。HLA-G基因编码的产物即HLA-G分子,由于mRNA的不同拼接方式,HLA-G分子有多种同种型,其中最为常见的是完整的HLA-G1(表达在细胞膜上)和缺乏跨膜区的HLA-G5(可溶性,又称sHLA-G1)。已有的研究显示HLA-G分子在免疫应答的调节中起着重要作用。含一半父源基因的胎儿在母体内不被排斥,原因之一是母胎界面有大量HLA-G分子的表达,HLA-G被认为参与诱导母胎界面的免疫耐受、被认为是妊娠成功的必要条件。近年来国内外学者对HLA-G都给予极大的关注,但真核表达难以达到需要的量,阻碍了对其功能的认识,而原核表达可弥补此不足。本研究在已有工作基础上,通过原核表达、体外折叠的方法制备具有天然构象的可溶性HLA-G,并应用于探讨其对天然免疫细胞的影响。我们选择外周血单核细胞在LPS作用下产生TNF作为模型,观察原核表达、体外折叠的HLA-G对该模型的影响,从而进一步了解HLA-G的生物学功能。目的:通过原核表达、体外折叠的方法制备具有天然构象的可溶性HLA-G,并探讨其对人PBMC产生TNF的影响。方法:通过原核表达获得的HLA-G5重链和轻链(β2m),经初步纯化后,利用稀释法与人工合成的九肽(KGPPAALTL)一起进行体外复性折叠,形成HLA-G5-抗原肽复合物;利用与天然HLA I类分子构象表位结合的单抗W6/32,经非变性电泳(Native-PAGE)/Western blot和双抗夹心ELISA法来鉴定折叠产物的构象。利用单核细胞受LPS刺激后产生TNF的特点,观察原核表达,体外折叠的HLA-G5对单核细胞分泌TNF的影响,TNF分泌量采用TNF敏感的L929细胞进行生物法测定。结果:原核表达体外折叠的HLA-G5经非变性电泳后,除了见到HC、LC位置的条带外,还可见到一新增条带;用Western blot检测该条带能够与HLAⅠ类分子的单抗W6/32结合;用W6/32和β2M抗体进行夹心ELISA鉴定折叠HLA-G5(3个复孔吸光度值的均值,OD490nm)为2.6168,而折叠HC为0.3716、折叠LC为0.6046、HLA-A*2402为1.8122、PBS为0.3784,折叠HLA-G5组的吸光度值均值与其他各组相比较,差异具有显著性(P<0.01)。从人外周血分离得到的PBMC分别加入HLA-G5+LPS、HC+LPS、LC+LPS及单独LPS(空白对照组)培养12h后获得无色的含TNF的上清,另设只加DMEM的阴性对照组,培养至24 h时,镜下可见到阴性对照组长势一般但无细胞碎屑出现,HLA-G实验组呈现满视野细胞碎片,其它组细胞碎片也有所增加但还有少许存活细胞。以结晶紫染色后用酶标仪测吸光度值(OD570nm),各个组均设三个复孔,取50%杀伤处吸光度值均值,结果(杀伤率)如下:折叠HLA-G5为45.85%、折叠HC为18.37%、折叠LC为16.55%、空白对照组为7.09%,折叠HLA-G5组的吸光度值均值与其他各组相比较,差异具有显著性(P<0.05)。结论:原核表达可以获得足够量的HLA-G5的轻链及重链,经过体外折叠复性的HLA-G5具有HLAⅠ类分子的天然构象,体外细胞功能实验显示折叠的HLA-G5能够促进人单核细胞分泌TNF。