湖北麦冬(Liriope spicata(Thunb.)Lout.var.prolifera Y.T.Ma)为《中华人民共和国药典》(1995年、2000年和2005年版)收载中药品种“山麦冬”(Radix Liriopes)的主要来源植物,具有悠久的药用历史,早在宋代《图经本草》和《证类本草》中均有湖北“随州麦门冬”的记载,据其药图考证,与现今药用的湖北麦冬基本一致。湖北麦冬是湖北的特有物种和道地药材,主产于湖北省襄樊市,种植面积已达5万余亩,年产量近两万吨,约占全国麦冬类药材总产量的5 0%以上,是当前麦冬商品药材的主流品种,种植湖北麦冬成为当地农民脱贫致富的主要产业之一。本论文在中医药理论指导下,运用分子生物学、中药栽培学、中药鉴定学、药理学等多学科交叉的方法对湖北麦冬及麦冬类植物ISSR鉴别、规范化种植、药用部位的选择与扩大、有效成分的提取分离、药效学及产业化开发等进行全方位系统研究,深入研究和证实湖北麦冬的药用价值,真正提高湖北麦冬的产量、质量和品牌知名度,为湖北麦冬的产业化开发奠定基础。1.湖北麦冬规范化种植研究1.1研究目的:对湖北麦冬进行规范化种植(GAP)研究,对湖北麦冬药材生产实施全面质量管理,控制影响药材质量的各种因子,规范药材生产的各个环节乃至全过程,以达到湖北麦冬药材“安全、有效、产量稳定、质量稳定、可控”的目的。形成优质、高产、无公害的模式化栽培技术,制定出行之有效的中药材生产、质量管理标准操作规程和企业质量标准,更好地指导中药材种植,从而提高湖北麦冬产量和质量。1.2研究方法:以《中药材生产质量管理规范(GAP)实施指南》为指导,主要针对湖北麦冬的生长特性、种植历史和规模、产地生态环境、物种鉴定、种质来源、野生资源分布情况、生长习性、良种繁育情况、适宜采收期、病虫害综合防治情况、质量控制、种植流程及关键技术控制点、产地生态环境检测(包括土壤、灌溉水、大气环境)、企业质量标准、取样方法、生产标准操作规程(SOP)、管理规程、技术标准、岗位职责等方面进行研究。1.3研究结果:通过对湖北麦冬开展规范化种植研究,建立了一套较为完整、规范的栽培、种植、初加工的生产和质量体系。制定出了《湖北麦冬种苗标准》、《湖北麦冬生产标准操作规程》(SOP)、《湖北麦冬企业质量标准》等。并能卓有成效地指导基地生产实践,提高了湖北麦冬的产量、质量和品牌知名度。1.4研究结论:实施湖北麦冬规范化种植(GAP)研究,能从源头上控制湖北麦冬药材质量,对保证湖北麦冬药材、湖北麦冬饮片及湖北麦冬中成药质量具有十分重要的意义。2.湖北麦冬及其他麦冬类植物ISSR鉴别研究2.1研究目的:对从形态上难以区分的湖北麦冬、短葶山麦冬、川麦冬、阔叶麦冬和细叶麦冬等麦冬类植物,利用ISSR分子标记技术进行鉴别研究,并研究其亲缘关系。2.2研究方法:选择索莱宝植物基因组DNA提取试剂盒提取样品总DNA,检测其浓度,将产物置于-20℃低温保存备用;根据预实验,设计五因素四水平正交实验,进行PCR反应体系的优化;从ISSR引物序列表中随机选取80条,按照正交试验优化确定的反应体系,对所有样品进行PCR扩增,选取对各样品均能稳定扩增出三条以上电泳条带的引物作为实验有效引物;对PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶分离检测,在凝胶成像分析系统下检测提取效果并拍照;统计各样品的电泳条带,得到全部样品的ISSR图谱二态数据矩阵,用NTSYS2.10软件计算个体间的Nei相似系数,进行UPGMA聚类分析,构建聚类系统树状图。2.3研究结果:通过正交优化实验建立了反应稳定、重复性好、条带清晰的最佳ISSR反应体系和PCR扩增程序;对麦冬类植物用此反应体系进行有效引物筛选,从80条引物中筛选出了9个有效引物,根据有效引物扩增结果进行聚类和相似系数分析,结果证明麦冬类植物亲缘关系十分接近,属于同一种群,其中湖北麦冬和短葶山麦冬亲缘关系较近,川麦冬和阔叶麦冬亲缘关系较近,这与传统分类及与品种鉴定结果相符。2.4研究结论:ISSR分子标记技术可用于麦冬类药材及近缘种的鉴别。3.湖北麦冬提取物(总多糖和总皂苷)的制备3.1研究目的:研究利用大孔吸附树脂同步提取、分离和纯化湖北麦冬中总多糖和总皂苷,并制定制备流程。3.2研究方法:对湖北麦冬药材进行水提,利用经过预处理的大孔吸附树脂分离湖北麦冬中的总多糖和总皂苷,利用旋转蒸发及醇沉的方法纯化总多糖和总皂苷,并进行含量测定。3.3研究结果:通过大孔吸附树脂同步提取、分离和纯化湖北麦冬总多糖和总皂苷,得到含量为66.52%的总多糖及含量为81.15%的总皂苷。3.4研究结论:运用大孔吸附树脂法同步提取湖北麦冬中的总皂苷和总多糖,步骤少,操作性强,易产业化,值得推广应用。4.湖北麦冬不同提取物降血糖作用的研究4.1研究目的:为证实湖北麦冬所含总多糖和总皂苷是否与麦冬多糖和皂苷一样具有降血糖作用,本实验设计使用湖北麦冬总多糖、湖北麦冬总皂苷以及湖北麦冬总提取物,对四氧嘧啶糖尿病大鼠进行降血糖作用的比较研究。4.2研究方法:选择体重(2 00±20)g的Wistar大鼠,造模前测基础血糖值,禁食24h,四氧嘧啶水溶液腹腔注射一次给药(120mg/kg),1次/d,连续2d。48h后测定禁食12h的空腹血糖(取大鼠尾血),挑选空腹血糖值达到14.00mmol/L以上者继续进行降糖实验。将造模成功大鼠随机分为6组,每组10只,分别灌胃下列药物:①高血糖模型组,正常喂食;②达美康组(0.04g/kg/d);③湖北麦冬总多糖组(0.4g/kg/d);④湖北麦冬总皂苷组(0.4g/kg/d);⑤湖北麦冬总提取物(水提液)组(5ml/kg/d);⑥正常对照组10只,正常喂食。按以上剂量灌胃分别给予各种药物,连续14d,第7d、14d给药前空腹12h,测定血糖。对实验结果运用SPSS16统计软件进行数据分析。4.3研究结果:湖北麦冬总多糖、湖北麦冬总皂苷、湖北麦冬总提物与阳性药达美康一样与模型组比较均有显著性差异,说明湖北麦冬不同提取物对四氧嘧啶致糖尿病大鼠具有显著降血糖作用,其中降糖效果为湖北麦冬总多糖>湖北麦冬总皂苷>湖北麦冬总提取物。4.4研究结论:湖北麦冬不同提取物对四氧嘧啶糖尿病大鼠均有不同程度的降血糖作用。