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脊髓背角小胶质细胞的激活参与中枢痛敏的形成,在神经病理性疼痛的发生和维持中起着重要作用。以往文献报道,外周神经损伤后,会造成脊髓水平痛觉敏感化,这其中有表达于脊髓背角小胶质细胞的P2Y13受体的参与。但目前我们并不清楚糖尿病神经病理性疼痛的发生过程是否同样有脊髓背角小胶质细胞P2Y13受体的参与。因此,本课题采用大鼠糖尿病神经痛模型,从在体和离体两个方面,综合应用疼痛行为学测定、分子生物学检测、细胞培养技术等方法,观察:(1)糖尿病大鼠疼痛行为学表现;(2)糖尿病大鼠脊髓背角小胶质细胞活性与P2Y13受体表达变化;(3)鞘内给予MRS2211(P2Y13受体拮抗剂)是否会对糖尿病大鼠疼痛行为学表现产生影响;(4)鞘内给予MRS2211是否会对糖尿病大鼠脊髓背角小胶质细胞的活性与IL-6表达造成影响;(5)离体状态下,MRS2211是否可以影响ADP(P2Y受体激动剂)诱导背角小胶质细胞激活与IL-6的合成与释放。该实验为探索糖尿病神经性疼痛的机理研究提供新的思路,有助于为以小胶质细胞为靶点开发新型的镇痛药物提供理论基础。目的:1.明确脊髓背角P2Y13受体是否参与糖尿病大鼠神经性疼痛的发生与维持。2.明确离体状态下,P2Y13受体是否可以影响ADP诱发的脊髓背角小胶质细胞功能变化。方法:1.成年SD大鼠,随机分为4组(n=8):对照组(仅鞘内给予生理盐水)、药物+空白对照组(鞘内给予100pmol/L MRS2211)、糖尿病大鼠模型组(Diabetes mellitus,DM组)、MRS2211处理组(糖尿病大鼠+鞘内注射100pmol/L MRS2211)。各组大鼠均鞘内置管。糖尿病大鼠模型组及MRS2211处理组单次腹腔注射60mg/kg的链脲菌素(Streptozocin,STZ),72h后测定血糖值≥16.7mmol/L,即造模成功。随后各组大鼠在造模2w时分别鞘内注射生理盐水或MRS2211(100pmol/L),每日2次,分别在STZ注射前1d、STZ注射后第2,4,6w测定给药1h后机械缩足反射阈值(Mechanical withdrawl threshold,MWT);采用免疫印迹的方法对2、4、6w时大鼠脊髓背角部位P2Y13受体、Iba-1和IL-6的表达情况进行观察。同时观察鞘内给予MRS2211是否会对糖尿病大鼠的血糖值、尿糖值、体重及饮水量等产生影响。2.取新生(3d以内)SD乳鼠脊髓背角培养小胶质细胞并予以纯化,荧光定量PCR(RTFQ-PCR)技术观察检测P2Y13受体拮抗剂MRS2211(10μmol/L)作用前后,ADP(10μmol/L)刺激小胶质细胞Iba-1 m RNA和IL-6 m RNA表达变化。ELISA技术检测MRS2211(10μmol/L)作用前后,ADP刺激的小胶质细胞培养基上清液中IL-6水平的变化。结果:1.与control组相比,DM组大鼠空腹血糖水平在腹腔注射STZ 2w、4w、6w后明显上调(P<0.01),差异具有统计学意义;与control组(正常大鼠尿液中不含葡萄糖)相比,在DM组注射STZ后2w、4w、6w大鼠尿糖水平明显上调(P<0.01),差异具有统计学意义。与control相比,DM组大鼠腹腔注射STZ后2w、4w、6w体重明显下降(P<0.01)、饮水量明显增加(P<0.01),差异具有统计学意义。与DM组4w、6w相比较,MRS2211干预组在STZ注射4w和6w血糖、尿糖、体重、饮水量并没有明显变化,差异无统计学意义。这说明MRS2211对糖尿病大鼠的空腹血糖值、尿糖值、体重和24h饮水量没有产生显著的影响。2.与control组相比,DM组MWT明显降低(P<0.01),第2、4、6w末背角P2Y13受体、Iba-1和IL-6表达均明显上调(P<0.01)。与DM组4w,6w相比,MRS2211(100pmol/L)处理组脊髓背角P2Y13受体表达明显下调(P<0.01)。与DM组4w相比,MRS2211(100pmol/L)处理组MWT明显提高(P<0.01),脊髓背角Iba-1和IL-6表达明显下调(P<0.01);与DM组6w相比,MRS2211(100pmol/L)处理组MWT没有明显变化,脊髓背角Iba-1和IL-6表达也没有明显变化。这说明MRS2211浓度为100pmol/L即可在神经痛早期发挥镇痛效应。3.荧光定量PCR实验表明,MRS2211可以部分阻断ADP诱发的脊髓背角小胶质细胞Iba-1 m RNA表达上调(P<0.01),这说明此效应部分由P2Y13受体所介导;MRS2211可以完全阻断ADP诱发的脊髓背角小胶质细胞IL-6 m RNA表达上调(P<0.01),这说明此效应主要由P2Y13受体所介导;ELISA实验观察到ADP可以明显促进背角小胶质细胞IL-6释放(P<0.01),MRS2211可以部分阻断此效应(P<0.05),这说明此效应部分由P2Y13受体介导。结论:1.鞘内给予MRS2211(P2Y13受体特异性拮抗剂)对糖尿病大鼠早期的机械痛敏症状抑制作用非常明显,同时脊髓背角P2Y13受体、Iba-1和IL-6表达上调明显减弱。MRS2211在脊髓上所起到的镇痛作用有可能是通过影响背角小胶质细胞的功能活动而发挥的。2.P2Y13受体激活可以促进脊髓背角小胶质细胞Iba-1与IL-6 m RNA的表达上调并释放炎症因子IL-6。这有可能是脊髓背角P2Y13受体调节伤害性信息从外周传向中枢神经系统的机制之一。