论文部分内容阅读
研究背景 骨肉瘤是一种常见的恶性骨肿瘤，由于新辅助化疗的引入，骨肉瘤患者的5年生存率由过去的10％-20％提高至60％-70％。目前临床上骨肉瘤化疗以顺铂、阿霉素、环磷酰胺、甲胺蝶呤等药物为主。虽然骨肉瘤患者的总体生存率有了明显的提高，但仍有部分患者对常规化疗不敏感，这些患者的生存率仍然较低。同时大剂量化疗也带来一系列明显的毒副作用，单药化疗的毒副作用限制了这些药物的剂量及化疗效果。因此寻找新的化疗药物作为常规化疗耐药患者的术后替代化疗药物及化疗增敏药物成为一个热门的研究方向。苏拉明是一种合成的抗锥虫类药物，近来被广泛的应用于抗肿瘤的治疗研究中，并且发现苏拉明在肺癌、前列腺癌、乳腺癌等多种肿瘤中能够发挥出一定的生长抑制作用或诱导调亡的作用，其抗肿瘤作用与药物非特异性的阻断多种生长因子-受体的结合以及抑制蛋白酶类的活性有关。在骨肉瘤的研究中发现苏拉明能够抑制碱性磷酸酶及端粒酶的活性，并且对由多种生长因子刺激引起的骨肉瘤细胞增殖也有抑制作用。本实验旨在通过体外细胞培养，运用苏拉明单独化疗、苏拉明和顺铂联合化疗与单独顺铂化疗比较，观察其对骨肉瘤细胞株MG-63细胞增殖的影响，并结合一定的形态学观察，为苏拉明运用于骨肉瘤的临床治疗提供一定的实验依据。 材料与方法 一、实验材料 人骨肉瘤细胞株MG-63引自CCTCC 苏拉明 (Sigma公司) 顺铂 (江苏豪森制药有限公司) 2004浙江大学硕士学位论文 价T(51叨a公司)跪M培养基(Gibeol公司) DMSO(S 1 gma公司)胎牛血清(杭州四季清生物制品厂) 细胞培养箱(Heraeus)倒置显微镜(OL帅pus) 荧光显微镜(Ax 1 overt)全自动酶标仪(卯sys袱DYNEX) 移液器(Eppendorf)96孔板(Bioehemieals)二、实验方法 l、将人骨肉瘤细胞鹏一63常规培养于含体积分数1既胎牛血清(56℃水浴灭活30min)的视M培养基中，其中含100 U/ml青霉素和looU/m1链霉素，在37℃、5忧02、95%空气以及饱和湿度的条件下，在C0:孵箱内培养。用0.25%胰酶+0.02%EDTA消化贴壁的骨肉瘤细胞，传代培养48小时后取处于指数增殖期的细胞消化备用。 2、将细胞用培养液调成一定浓度后接种于96孔板上，每孔加1 00 ul细胞悬液(细胞浓度为1 x 105/祖)，孵箱内培养24h后细胞贴壁生长，铺壁约6既左右。次日加100 pl含药物的视M培养基，阴性对照组加100 pl培养基;顺铂组药物终浓度为5、2.5、1.25、0.625林g/ml;苏拉明组药物终浓度为400、200、100、50 pg/ml。联合化疗组加入顺铂和苏拉明后使药物最终浓度为顺铂2.5 pg加卜苏拉明200 pg/ml、顺铂1.25协g/ml+苏拉明200“g/ml、顺铂2.5协g/ml+苏拉明100 pg/m1、顺铂1.25 pg/m1+苏拉明100协g/ml.每个浓度设5个复孔，继续培养48h作解T细胞毒性检测。 3、在35ml玻璃培养瓶内接种细胞5ml(细胞浓度为1 x 10丫m1)，次日细胞铺壁约6叽，倒去原培养液后加入含药物苏拉明的培养液5ml，并且使药物最终浓度为200 pg/ml、100 pg/ml，继续在孵箱内培养72小时后于倒置显微镜下观察细胞形态学变化。三、统计学方法采用SPSSn.O统计软件对实验的数值结果进行统计学分析。 2004浙江大学硕士学位论文 结果一、单药作用对骨肉瘤细胞桃一63的细胞毒性实验结果 1、顺铂:浓度为0、0.625、1.25、2.5、5.0协g/m1的顺铂与骨肉瘤细胞株MGwe63作用48小时后吸光度A值分别为0.2694士(6.68 x 10‘)、0.2638士(4.05X10闷)、0.2328士(9.37 x 10咦)、0.2258士(7.65xl丫)、0.1510士(2.83x10闷)，其Cl值分别为2.08%、13.59%、16.18%、43.94%。其中浓度为5.0、2.spg/ml的顺铂与对照相比有统计学显著差异(P<0 .01);浓度为1.25 pg/m1的顺铂与对照相比有统计学差异(P<0 .05);0.625 pg/m1的顺铂与对照组相比无统计学显著差异，(P>0 .05)。 2、苏拉明:浓度为O、50、100、200、400协g/m1的苏拉明与骨肉瘤细胞株毗一63作用48小时后吸光度A值分别为0.2694士(6.68 x 10一)、0.2568士(9.22x 10一)、0.2392士(4.42 x 10一)、0.1914士(1.94x10闷)、0.1874士(9.45xl0闷)，其Cl值分别为4.6既、1 1.21%、28.95%、30.4钱。其中浓度为400、200、100pg/m1的苏拉明与对照相比有统计学显著差异(P<0 .01):50协g/m1的苏拉明与对照相比无统计学显著差异(P>0 .05)。二、苏拉明单独作用72小时后骨肉瘤细胞株珊一63形态学改变 毗一63细胞经200、100 pg加l的苏拉明作用72小时后运用倒置显微镜观察培养瓶内的细胞可见较多漂浮死细胞，200协g/m1组较100协g/耐组更为明显，其漂浮细胞成团聚集;两组均可以观察到细胞形态发生改变，细胞周缘伸出较多细长的突起，细胞密度减小。三、顺铂和苏拉明联合化疗对骨肉瘤细胞淞一63的细胞毒性实验结果 顺铂2.5 pg/ml+苏拉明200 pg/ml、顺铂1.25 pg/ml+苏拉明200 pg/ml、顺铂2.5“g/ml+苏拉明100协g/ml、顺铂1.25协g/ml+苏拉明100 pg/ml作用MG一63